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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 目的片段连表达载体
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ashap

新虫 (初入文坛)

[求助] 目的片段连表达载体

各位求助！！！
我的目的片段大小为2273bp,在连接pMD19T载体后摇菌酶切验证，切下边一条带，与表达载体（7800bp）连接，后可以长出菌来，但是单酶切验证时大小却在4000bp以上。
我都做了几次了，问了别人，说是可能是目的片段与T载体再次连接；我制了块长胶，跑到两条带分开，再切下边一条带，结果还是和原来一样。
目的片段连表达载体
1.jpg
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1楼 2013-09-17 18:24:28
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-20 20:05:38
与表达载体相连后的单酶切确定没有问题吗？做了双酶切、其它酶切位点的单酶切及未经酶切的质粒对照了吗？此外，你的表达载体也是氨苄抗性的吗？如果不是，筛出来的不可能是与T载体相连的。
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2楼2013-09-17 23:59:42
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ashap

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-09-17 23:59:42
与表达载体相连后的单酶切确定没有问题吗？做了双酶切、其它酶切位点的单酶切及未经酶切的质粒对照了吗？此外，你的表达载体也是氨苄抗性的吗？如果不是，筛出来的不可能是与T载体相连的。

单酶切了，就是片段不大小不对。

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3楼2013-09-18 07:17:10
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-20 20:05:45
引用回帖:
3楼: Originally posted by ashap at 2013-09-18 07:17:10
单酶切了，就是片段不大小不对。
...

如果是这样，首先检查一下你回收的载体片段和目的片段是否正确。尤其是从T载体回收的片段是否正确，如果有引物，可以P一下。如果没有引物，看目的片段中间是否有特异的酶切位点。
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4楼2013-09-19 00:39:12
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