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ashap

新虫 (初入文坛)

[求助] 目的片段连表达载体

各位求助!!!
我的目的片段大小为2273bp,在连接pMD19T载体后摇菌酶切验证,切下边一条带,与表达载体(7800bp)连接,后可以长出菌来,但是单酶切验证时大小却在4000bp以上。
我都做了几次了,问了别人,说是可能是目的片段与T载体再次连接;我制了块长胶,跑到两条带分开,再切下边一条带,结果还是和原来一样。
目的片段连表达载体
1.jpg
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ashap

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-09-17 23:59:42
与表达载体相连后的单酶切确定没有问题吗?做了双酶切、其它酶切位点的单酶切及未经酶切的质粒对照了吗?此外,你的表达载体也是氨苄抗性的吗?如果不是,筛出来的不可能是与T载体相连的。

单酶切了,就是片段不大小不对。

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2013-09-18 07:17:10
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-20 20:05:38
与表达载体相连后的单酶切确定没有问题吗?做了双酶切、其它酶切位点的单酶切及未经酶切的质粒对照了吗?此外,你的表达载体也是氨苄抗性的吗?如果不是,筛出来的不可能是与T载体相连的。
2楼2013-09-17 23:59:42
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-20 20:05:45
引用回帖:
3楼: Originally posted by ashap at 2013-09-18 07:17:10
单酶切了,就是片段不大小不对。
...

如果是这样,首先检查一下你回收的载体片段和目的片段是否正确。尤其是从T载体回收的片段是否正确,如果有引物,可以P一下。如果没有引物,看目的片段中间是否有特异的酶切位点。
4楼2013-09-19 00:39:12
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