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hongcaier

铁虫 (初入文坛)

[求助] RIPA提取总蛋白浓度低的原因

求各位大虾帮忙
我用6cm培养皿细胞转染后提总蛋白，细胞长得很满。
方法是：用PBS洗细胞三次后，用RIPA，每皿加100ul，100:1加pmsf cocktail。冰上裂解细胞。冰上放置20min后用细胞刮把细胞刮下，吸到EP管中。放在冰上静置25min。4℃离心12000g 10min，取上清。测浓度，浓度很低。
求问原因？
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1楼2013-09-17 10:57:01
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xiangyu9356

至尊木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-17 14:43:16
hongcaier: 金币+5, ★有帮助 2013-09-23 12:49:49
如果蛋白浓度很低的话，建议检查蛋白酶抑制剂是否失效。如果以前没有加蛋白酶抑制剂的习惯话建议配制裂解液时添加。另：加入裂解液裂解细胞时不用在冰上放置太长时间，我一般是加入裂解液后1-3min就开始刮；吸到EP管中我一般是超声破碎，减少放置时间。祝好！
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满堂花醉三千客，更无一人是知音。
2楼2013-09-17 13:02:34
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hongcaier

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xiangyu9356 at 2013-09-17 13:02:34
如果蛋白浓度很低的话，建议检查蛋白酶抑制剂是否失效。如果以前没有加蛋白酶抑制剂的习惯话建议配制裂解液时添加。另：加入裂解液裂解细胞时不用在冰上放置太长时间，我一般是加入裂解液后1-3min就开始刮；吸到EP管 ...

蛋白酶抑制剂加了的，还有放冰上时间一共45min，也没有好长时间。应该也不会影响啊。谢谢哈
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3楼2013-09-17 13:38:39
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