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lizhijiang木虫 (著名写手)
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[交流]
蛋白酶活性测定-酶谱法已有3人参与
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酶谱法是测定蛋白酶活性的一种敏感方法之一，是用含蛋白酶作用底物的蛋白制成的分离胶，由于酶解作用使胶中相应底物发生分解，致使酶解部分背景透明；也可检测酶对casein或特异性底物作用的方法之一。 现将文献和本人写作中提到的酶方法做一简要英文介绍。简言之，与SDS-PAGE法有极其类似之处。区别在于，酶谱法：1、样品不用煮沸。2、在分离胶中取出部分水溶解casein或特异性蛋白底物，制成含0.1或0.5%酶作用底物的分离胶（再在分离胶中加入所需的分离胶制备用水）。3、酶作用的底物嵌于分离胶中，因此与普通SDS-PAGE胶相比，胶空隙更小。因此，不可用marker，因为分离胶中遍布蛋白底物，染色后除酶解部位是透明颜色，而其他部分蓝色。4、电泳后，孵育过程很重要，所以溶液配制中，尤其钙离子激活酶活很重要；染色、脱色与sds-page差别不大。 如有疑问，可在回帖中交流。不当之处请指导。 Zymography The proteolytic zymography was performed in conjunction with SDS-PAGE according to the modified method of García-Carreño et al. and Laemmli. Ten percent separating gel was prepared in the presence of the final concentration of 0.1% casein or specific substrate, respectively. The enzyme, or specific enzyme were loaded on the 5% stacking gel and run electrophoresis. After electrophoresis, the gels were rinsed in distilled water and eluted for 40 min in a shaking water bath with 50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6) containing 2.5% Triton X-100 and 5 mmol/L CaCl2. Subsequently, the casein- and specific substrate -zymography gel were washed with 50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6) containing 5 mmol/L CaCl2 for 40 min and incubated with 50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4) containing 150 mmol/L NaCl, 10 mmol/L CaCl2, and 0.02% NaN3 at 37 ℃ for 42 h. Then the gels were stained by Coomassie brilliant blue R-250 for 3 h and rinsed by the destainer containing 40% ethanol and 10% acetic acid. |
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