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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切，连接，转化，已快崩溃
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sars37

捐助贵宾 (小有名气)

[交流] 酶切，连接，转化，已快崩溃

做TA克隆已经2个多月了，一开始出的问题是胶回收的浓度太低，后来发现不能按说明书上的做，看别人的文献同一个试剂都是离心1分钟的，说明书是离心30秒，好不容易回收率高一点，连接转化又不行，昨晚11点涂的板子，到现在才长出2、3个菌落，已经不报什么希望了，回收试剂盒都被我用完了，老板表示你做了这么久都做不出来，让我换课题，这都费心这么久了，说换就换了吗，我觉得我还可以抢救一下啊，决心自己花钱买个胶回收试剂盒，我觉得我能做出来！
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1楼 2013-09-03 14:35:06
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jlc0225

至尊木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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sars37: 金币+3 2013-09-03 20:44:52
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-03 20:57:21
一般说明书上写离心30S都得离心2min。耐心点，有时候需要搞清楚是什么试剂出了问题，有时是超纯水有问题。胶回收试剂盒是什么牌子的？是连接不行还是转化不行？祝实验顺利！
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3楼2013-09-03 15:34:49
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grape_vine

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
这老板真是的,还真把这个当个课题了阿!
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4楼2013-09-03 16:52:01
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飞扬~~~

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by grape_vine at 2013-09-03 16:52:01
这老板真是的,还真把这个当个课题了阿!

？？？能够解释解释吗？
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5楼2013-09-03 17:20:17
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2008101111

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
sars37: 金币+3 2013-09-03 20:45:06
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-03 20:57:41
这个长2-3个单克隆很正常，阳性克隆的可能性很大，胶回收试剂盒又没几个钱，你们老板真抠，如果试剂盒回收结果不好的话，就换个贵点的，我们实验室长期摸索就得OMEG的胶回收试剂盒回收效率还是很高的，顺带问一下你们的TA载体怎么弄的？买的吗？
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6楼2013-09-03 20:18:04
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guojing113

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-03 20:57:50
TA克隆只是做保藏扩增用的，很少有实验的最后结果用的就是TA克隆如果楼主的最终目的不是连接TA，可以直接把引物设计好连接到目的质粒
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7楼2013-09-03 20:41:23
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sars37

捐助贵宾 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jlc0225 at 2013-09-03 15:34:49
一般说明书上写离心30S都得离心2min。耐心点，有时候需要搞清楚是什么试剂出了问题，有时是超纯水有问题。胶回收试剂盒是什么牌子的？是连接不行还是转化不行？祝实验顺利！

是QIANGEN的 回收到的浓度只有10左右。。然后连接转化后就少许几个菌落，小提出来酶切都不对
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8楼2013-09-03 20:42:39
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sars37

捐助贵宾 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 2008101111 at 2013-09-03 20:18:04
这个长2-3个单克隆很正常，阳性克隆的可能性很大，胶回收试剂盒又没几个钱，你们老板真抠，如果试剂盒回收结果不好的话，就换个贵点的，我们实验室长期摸索就得OMEG的胶回收试剂盒回收效率还是很高的，顺带问一下你 ...

对的 T质粒是买的，但是插入目的片段是自己做的，但是是师姐做的，现在师姐走了，我什么都不会。我老板一直不相信国内的试剂，所有基本上都买国外的，现在用的是QIAGEN的。
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9楼2013-09-03 20:44:40
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sars37

捐助贵宾 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 2008101111 at 2013-09-03 20:18:04
这个长2-3个单克隆很正常，阳性克隆的可能性很大，胶回收试剂盒又没几个钱，你们老板真抠，如果试剂盒回收结果不好的话，就换个贵点的，我们实验室长期摸索就得OMEG的胶回收试剂盒回收效率还是很高的，顺带问一下你 ...

刚刚把长出的克隆，2个皿，共七个挑出来摇菌了，希望明天能有奇迹。
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10楼2013-09-03 20:45:41
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grape_vine

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by 飞扬~~~ at 2013-09-03 17:20:17
？？？能够解释解释吗？...

这只能算一个课题里面非常小的一部分阿,即使是用完了一个试剂盒,也没必要因为克隆做不出来而换课题阿!
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11楼2013-09-03 20:47:59
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sars37

捐助贵宾 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jlc0225 at 2013-09-03 15:34:49
一般说明书上写离心30S都得离心2min。耐心点，有时候需要搞清楚是什么试剂出了问题，有时是超纯水有问题。胶回收试剂盒是什么牌子的？是连接不行还是转化不行？祝实验顺利！

离心时间长一点没关系吗，国产的过柱试剂盒离心长一点也没事吧，准备自己买个国产过柱的，现在这种不是过柱的，据说回收效果没有过柱的好。
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12楼2013-09-03 20:48:57
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飞扬~~~

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
11楼: Originally posted by grape_vine at 2013-09-03 20:47:59
这只能算一个课题里面非常小的一部分阿,即使是用完了一个试剂盒,也没必要因为克隆做不出来而换课题阿!...

那是要继续做下去？
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13楼2013-09-03 20:53:01
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2008101111

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
10楼: Originally posted by sars37 at 2013-09-03 20:45:41
刚刚把长出的克隆，2个皿，共七个挑出来摇菌了，希望明天能有奇迹。...

想问一下，你连接片段有多大？单克隆是用菌落PCR鉴定的吗？
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14楼2013-09-03 21:53:55
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-06 17:39:42
引用回帖:
9楼: Originally posted by sars37 at 2013-09-03 20:44:40
对的 T质粒是买的，但是插入目的片段是自己做的，但是是师姐做的，现在师姐走了，我什么都不会。我老板一直不相信国内的试剂，所有基本上都买国外的，现在用的是QIAGEN的。...

qiagen的盒子质量很有保障的，我每次按照protocol做后胶回收的效率在50%以上。如果你的PCR产物只有一条带，可以不用胶回收，直接沉淀也可以的。再说连接也不用太多DNA片段，一般回收后的浓度在十到几十足够连接用了。
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15楼2013-09-04 03:12:55
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grape_vine

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
13楼: Originally posted by 飞扬~~~ at 2013-09-03 20:53:01
那是要继续做下去？...

这个......嘿嘿,不让你自己花钱你就做吧!
还是要有原则哦! 不能自给花钱! 不然你就从学生变成了科研捐助者了呢!
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16楼2013-09-04 07:55:54
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yujitianqing

铁虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-06 17:39:34
酶切后就不是TA克隆了。有可能是酶切未切开，有可能目的片段较长，连接较困难。转化是否有问题？感受态有时也是个问题。实在找不出原因，做好做个对照。
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17楼2013-09-04 09:07:21
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pengpeng7196

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主，你的T载体有没有问题啊，先把T载体做个鉴定吧
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18楼2013-09-04 09:38:05
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sars37

捐助贵宾 (小有名气)
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14楼: Originally posted by 2008101111 at 2013-09-03 21:53:55
想问一下，你连接片段有多大？单克隆是用菌落PCR鉴定的吗？...

1000bp 提质粒酶切和PCR鉴定
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19楼2013-09-04 10:25:04
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sars37

捐助贵宾 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-09-04 03:12:55
qiagen的盒子质量很有保障的，我每次按照protocol做后胶回收的效率在50%以上。如果你的PCR产物只有一条带，可以不用胶回收，直接沉淀也可以的。再说连接也不用太多DNA片段，一般回收后的浓度在十到几十足够连接用了 ...

酶切的是在质粒上的片段还有纯化后的PCDNA 然后连接的，请问如何沉淀？
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20楼2013-09-04 10:27:05
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2008101111

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
19楼: Originally posted by sars37 at 2013-09-04 10:25:04
1000bp 提质粒酶切和PCR鉴定...

1000bp做TA克隆还是很简单的，如果片段大了就有点困难，楼主继续加油
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21楼2013-09-04 10:41:10
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随波逐刘

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-06 17:38:19
TA克隆前段时间刚做过，不长菌落有很多问题，换个感受态细胞试试，连接时，DNA片段与T-载体的比例问题，我试过DNA比载体大于10:1，长的菌落竟然没有比例0.5:0,5的多，我没有切胶回收，PCR产物直接回收了，差不多，DNA浓度我感觉不要太高了，1ulDNA足矣。。。。
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22楼2013-09-04 10:43:46
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因为吃饭

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我想说，我最近做转化，涂板长菌能长2、3个都很惊喜了。上次涂板就长了一个，检测出来还好是阳性。我觉得阳性克隆的可能性相当大！
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23楼2013-09-04 10:44:54
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qinchunjing

银虫 (初入文坛)
★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-06 17:38:29
如果目的片段不是特别大的话，基本上回收的片段就够用了吧。可以测一下回收片段的浓度，再做连接。
平板不长克隆，个人感觉在转化步骤出问题的可能性更大，有可能是感受态细胞的转化效率太低所致。我是因为感受态细胞转化效率低，在这步实验中纠结了很久
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24楼2013-09-04 15:05:52
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sars37

捐助贵宾 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-09-04 03:12:55
qiagen的盒子质量很有保障的，我每次按照protocol做后胶回收的效率在50%以上。如果你的PCR产物只有一条带，可以不用胶回收，直接沉淀也可以的。再说连接也不用太多DNA片段，一般回收后的浓度在十到几十足够连接用了 ...

今天提质粒后酶切PCR验证跑胶，酶切的有几个被切下来了，而且大小也正确，但是PCR的却没有。。请问是不是我的循环数少了？我循环数28个，条带比较淡，是不是PCR体系里多加点模板？我是用带myc和酶切位点的引物跑的PCR，如果直接用目的片段的引物跑出来是不是也可以？
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25楼2013-09-04 16:30:07
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sars37

捐助贵宾 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-09-04 03:12:55
qiagen的盒子质量很有保障的，我每次按照protocol做后胶回收的效率在50%以上。如果你的PCR产物只有一条带，可以不用胶回收，直接沉淀也可以的。再说连接也不用太多DNA片段，一般回收后的浓度在十到几十足够连接用了 ...

还有我想弱弱的问一下。PCR体系多加模板的话其他引物和BUFFER啥的不用变吧，就少加点水吧
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26楼2013-09-04 16:32:11
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小小技术官

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
换一只新的T载体。
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27楼2013-09-04 21:55:18
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忽而今秋

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-06 17:38:40
胶回收要打长波切。我倒是也做了一段时间，前面基本各种纠结，后来网上学习学习改进体系，现在只要能拉出来基本一次直接ok.

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28楼2013-09-05 00:17:38
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-06 17:38:50
引用回帖:
20楼: Originally posted by sars37 at 2013-09-04 10:27:05
酶切的是在质粒上的片段还有纯化后的PCDNA 然后连接的，请问如何沉淀？...

切质粒如果只是切掉很小的序列，也可以直接沉淀。沉淀就是用2.5V无水乙醇沉淀DNA，如果老板不给买盒子的话。
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29楼2013-09-05 01:30:51
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-06 17:39:00
引用回帖:
26楼: Originally posted by sars37 at 2013-09-04 16:32:11
还有我想弱弱的问一下。PCR体系多加模板的话其他引物和BUFFER啥的不用变吧，就少加点水吧...

PCR体系各种成分的浓度都是大致固定的，多加模板的话减小水的体积就可以了。PCR时模板要适量，太多的话也可能会P不出来的。
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30楼2013-09-05 01:33:02
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roomofxw

木虫 (正式写手)
★
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是不是酶不行
换个酶，做做加A反应？
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31楼2013-09-05 09:16:04
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易水寒明

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你老板真好，我老板要是给我换课题就好了。
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32楼2013-09-05 09:43:42
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sars37

捐助贵宾 (小有名气)
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30楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-09-05 01:33:02
PCR体系各种成分的浓度都是大致固定的，多加模板的话减小水的体积就可以了。PCR时模板要适量，太多的话也可能会P不出来的。...

有没有可能是引物的问题？我用的是带myc和酶切位点的引物，现在还有一个是只带myc的全长引物，这个全长引物如果能跑出来1000左右的条带是不是也能证明连接正确而呢？
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33楼2013-09-05 09:46:29
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RUI1990

银虫 (小有名气)
祝你好运！
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34楼2013-09-05 11:45:03
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冰风颤木

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-06 17:39:13
楼主你是新手吧？T克隆做不出来多半是你的感受态的问题 好好研究研究感受态吧 做感受态一定要冰浴  祝你好运
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35楼2013-09-06 15:30:45
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lifei13089

铁虫 (初入文坛)
祝好运
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36楼2013-09-09 22:11:34
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yuliansheng

金虫 (小有名气)
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你好，千万别失望，做实验就是这个样子，总是在失败中成长。不光你一个人失败，每个人都在失败，失败中总结经验，不断改进，才能成功。
你能这么一直坚持，已经很努力了。提几个建议，不知道能不能帮上你:
1，competent cells（感受态细胞）有没有问题，我前两天和你遇到了一样的问题，觉得好像是competent cells时间有点长了。重新做了一次competent cells，结果成功了，长出了许多菌。
2，做连接时，加入的酶切质粒的量一定要少，大概和target DNA的比例是1:3~1:10,可以在进行电泳后进行band比较，大概量符合那个比例就可以。
3，酶切质粒和DNA的量都不应该太多，原因有二:一是，量多，连不上；二是，导入受体细胞不好导入。
4，如果做了好多次，胶回收的浓度都太低，倒不如一次多做几个sample，一起电泳进行胶回收。这样估计能增加你的回收量。回收完后最好要做“酒精沉淀”进行提纯，
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37楼2013-09-09 22:35:03
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crystalatom

木虫 (小有名气)
建议换InFusion
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38楼2013-09-10 00:26:41
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无忧的枫落

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
3楼: Originally posted by jlc0225 at 2013-09-03 15:34:49
一般说明书上写离心30S都得离心2min。耐心点，有时候需要搞清楚是什么试剂出了问题，有时是超纯水有问题。胶回收试剂盒是什么牌子的？是连接不行还是转化不行？祝实验顺利！

离心2min可以增加回收率吗？
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39楼2014-07-14 11:06:08
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
★
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胶回收的DNA浓度是低，有时候个位数，但这不影响后继实验。T载体的连接效率很高。
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40楼2014-07-14 14:14:22
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夏至1990

金虫 (小有名气)
★
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4楼: Originally posted by grape_vine at 2013-09-03 16:52:01
这老板真是的,还真把这个当个课题了阿!

2楼，这太伤楼主的心了
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41楼2014-07-14 14:50:09
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夏至1990

金虫 (小有名气)
怎么说了，我也要开始，希望一切顺利
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42楼2014-07-14 14:51:15
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bihaijushi2楼
2013-09-03 15:14   回复  
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