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sars37

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虫号: 2544220

[交流] 酶切，连接，转化，已快崩溃

做TA克隆已经2个多月了，一开始出的问题是胶回收的浓度太低，后来发现不能按说明书上的做，看别人的文献同一个试剂都是离心1分钟的，说明书是离心30秒，好不容易回收率高一点，连接转化又不行，昨晚11点涂的板子，到现在才长出2、3个菌落，已经不报什么希望了，回收试剂盒都被我用完了，老板表示你做了这么久都做不出来，让我换课题，这都费心这么久了，说换就换了吗，我觉得我还可以抢救一下啊，决心自己花钱买个胶回收试剂盒，我觉得我能做出来！

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【求助/交流】单酶切连接的克隆急…… 已经有10人回复

1楼 2013-09-03 14:35:06

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yuliansheng

金虫 (小有名气)

★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖

你好，千万别失望，做实验就是这个样子，总是在失败中成长。不光你一个人失败，每个人都在失败，失败中总结经验，不断改进，才能成功。
你能这么一直坚持，已经很努力了。提几个建议，不知道能不能帮上你:
1，competent cells（感受态细胞）有没有问题，我前两天和你遇到了一样的问题，觉得好像是competent cells时间有点长了。重新做了一次competent cells，结果成功了，长出了许多菌。
2，做连接时，加入的酶切质粒的量一定要少，大概和target DNA的比例是1:3~1:10,可以在进行电泳后进行band比较，大概量符合那个比例就可以。
3，酶切质粒和DNA的量都不应该太多，原因有二:一是，量多，连不上；二是，导入受体细胞不好导入。
4，如果做了好多次，胶回收的浓度都太低，倒不如一次多做几个sample，一起电泳进行胶回收。这样估计能增加你的回收量。回收完后最好要做“酒精沉淀”进行提纯，