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lhf903

金虫 (正式写手)

[求助] 土壤总DNA真菌PCR突然扩不出来了

土壤总DNA真菌PCR,通用引物NS1F,FungR。
     程序95℃ 5min,35cycles 95℃ 1min,57℃ 1min,72℃ 1min,最后72℃ 10min。一直扩得很好,前段时间扩不出来后,退火温度降到55℃扩出来了,没过几天55℃也扩不出来了,退火温度再往下降也没用了。
     不知道什么原因,模板没用问题,引物定了新的,试剂也没问题,现在找不出原因了~
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二月smile

新虫 (初入文坛)

楼主找到原因了吗?我也是真菌扩不出来。
5楼2015-07-17 10:39:33
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zhsp07

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-09-01 17:07:32
lhf903: 金币+20, 有帮助 2013-09-01 18:31:22
不太清楚这对引物。之前能扩出来,过了几天就扩不出来了,难道是因为这几天中DNA反复冻融,降解了?
扩增不出来的话,稀释试试吧,一般土壤DNA中腐植酸等杂质含量比较高,影响酶活性,不过如果0D260/230大于2的话,应该不是杂质的问题。
车到山前必有路!
2楼2013-08-29 08:30:01
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lhf903

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhsp07 at 2013-08-29 08:30:01
不太清楚这对引物。之前能扩出来,过了几天就扩不出来了,难道是因为这几天中DNA反复冻融,降解了?
扩增不出来的话,稀释试试吧,一般土壤DNA中腐植酸等杂质含量比较高,影响酶活性,不过如果0D260/230大于2的话, ...

看了很多PCR的注意事项,昨天刚稀释模板扩了一下,还是没扩出来。。。。。。。。
3楼2013-09-01 12:26:31
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zhsp07

金虫 (小有名气)

检测OD值了吗?我之前做的是单菌的DNA,由于OD260/230不合适而PCR不成功的,都是做稀释的,5倍到100倍不等,当然还要考虑DNA的含量。
我也挺好奇你的模板为什么会突然扩不出来,楼主找到原因后,麻烦告知一下啊。
车到山前必有路!
4楼2013-09-01 20:57:48
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