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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 土壤总DNA真菌PCR突然扩不出来了
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lhf903

金虫 (正式写手)

[求助] 土壤总DNA真菌PCR突然扩不出来了

土壤总DNA真菌PCR，通用引物NS1F，FungR。
     程序95℃ 5min，35cycles 95℃ 1min，57℃ 1min，72℃ 1min，最后72℃ 10min。一直扩得很好，前段时间扩不出来后，退火温度降到55℃扩出来了，没过几天55℃也扩不出来了，退火温度再往下降也没用了。
     不知道什么原因，模板没用问题，引物定了新的，试剂也没问题，现在找不出原因了~
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1楼 2013-08-28 15:24:00
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zhsp07

金虫 (小有名气)
检测OD值了吗？我之前做的是单菌的DNA，由于OD260/230不合适而PCR不成功的，都是做稀释的，5倍到100倍不等，当然还要考虑DNA的含量。
我也挺好奇你的模板为什么会突然扩不出来，楼主找到原因后，麻烦告知一下啊。
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车到山前必有路!
4楼2013-09-01 20:57:48
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zhsp07

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-09-01 17:07:32
lhf903: 金币+20, ★有帮助 2013-09-01 18:31:22
不太清楚这对引物。之前能扩出来，过了几天就扩不出来了，难道是因为这几天中DNA反复冻融，降解了？
扩增不出来的话，稀释试试吧，一般土壤DNA中腐植酸等杂质含量比较高，影响酶活性，不过如果0D260/230大于2的话，应该不是杂质的问题。
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车到山前必有路!
2楼2013-08-29 08:30:01
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lhf903

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhsp07 at 2013-08-29 08:30:01
不太清楚这对引物。之前能扩出来，过了几天就扩不出来了，难道是因为这几天中DNA反复冻融，降解了？
扩增不出来的话，稀释试试吧，一般土壤DNA中腐植酸等杂质含量比较高，影响酶活性，不过如果0D260/230大于2的话， ...

看了很多PCR的注意事项，昨天刚稀释模板扩了一下，还是没扩出来。。。。。。。。
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3楼2013-09-01 12:26:31
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二月smile

新虫 (初入文坛)
楼主找到原因了吗？我也是真菌扩不出来。
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5楼2015-07-17 10:39:33
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