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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 如何避免引物二聚体
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Eva2009

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核酸生物学实验经验 生物信息学 代谢毒理细胞生物

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1楼 2013-08-23 09:09:01
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pypsak

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-08-23 11:39:41
1.可能模板有问题；模板浓度过小，适当加大模板量；
2.Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；
3.取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；这点我试过,效果还不错
4.所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性；
5.PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。
6.增加循环数；
7.降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）；
8.若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在 20-25mmol/l没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。
9.以上次的pcr产物作模板二次pcr，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍；
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2楼2013-08-23 09:14:39
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Eva2009

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3楼2013-08-23 11:29:57
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
3楼: Originally posted by Eva2009 at 2013-08-23 11:29:57
这些俺也在百度上搜过，有没有试过哪种方法啊。。。。怎么让阴性对照里面不出现引物二聚体...

二聚体很严重吗？有一点不影响特异扩增的话不用管它的吧~ 减少引物量，升高退火温度，加镁离子一起用嘛，实在不行重新设计引物呗，没多少钱。
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我会绕一个圈，走回到实验室
4楼2013-08-23 12:53:35
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pypsak

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你跑的是Qpcr？普通pcr真没什么问题的
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5楼2013-08-23 13:13:35
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足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-23 18:03:30
做PCR之前，把PCR仪提前打开，先让模块温度升到90度以上，再往里放PCR管。可以在一定程度上减少引物二聚体的产生，但是如果你的阴性对照引物二聚体很严重的话，是无法完全避免的。降低引物的加入量，适当提高Tm值，都可以减少引物二聚体的产生。
以上只是我的个人经验，你可以试一下，如果不行。还是重新设计引物较好。
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6楼2013-08-23 13:33:25
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Eva2009

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7楼2013-08-26 09:13:49
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Eva2009

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8楼2013-08-26 09:14:31
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Eva2009

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9楼2013-08-26 09:16:53
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-10-19 21:01:50
你可以在Primer Premier软件的 Pimer--->Search Criteria---->选Manual（在“Search Mode”框），同时点击“Search Parameters"进入人工搜索参数设置窗口，其中有“Dimer/Hairpin”，可以将“Search Stringency”设置为：very high或者 Moderate。该程序会对引物进行相关参数的搜索和筛选。

Good Luck！
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10楼2013-10-19 16:06:17
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