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1楼2013-08-23 09:09:01

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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-10-19 21:01:50

你可以在Primer Premier软件的 Pimer--->Search Criteria---->选Manual（在“Search Mode”框），同时点击“Search Parameters"进入人工搜索参数设置窗口，其中有“Dimer/Hairpin”，可以将“Search Stringency”设置为：very high或者 Moderate。该程序会对引物进行相关参数的搜索和筛选。

Good Luck！

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10楼2013-10-19 16:06:17

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pypsak

金虫 (正式写手)

应助: 58 (初中生)
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专业: 微生物遗传育种学

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-08-23 11:39:41

1.可能模板有问题；模板浓度过小，适当加大模板量；
2.Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；
3.取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；这点我试过,效果还不错
4.所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性；
5.PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。
6.增加循环数；
7.降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）；
8.若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在 20-25mmol/l没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。
9.以上次的pcr产物作模板二次pcr，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍；

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2楼2013-08-23 09:14:39

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