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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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Eva2009

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Eva2009

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8楼2013-08-26 09:14:31
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pypsak

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-08-23 11:39:41
1.可能模板有问题;模板浓度过小,适当加大模板量;
2.Taq酶,引物,Mg2+浓度可能过高,可降低它们的浓度;
3.取你所要加的上下游引物混合后,在100摄氏度下的沸水中煮5分钟,然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却,这时再加入反应体系当中,引物二聚体就会消失的;这点我试过,效果还不错
4.所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO,可以增强特异性;
5.PCR反应体系的配制在冰上进行,最后加TAq酶,PCR结束后,产物勿放置在室温下过长时间,有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。
6.增加循环数;
7.降低退火温度后有条带,则应逐渐提高温度,若提高温度的同时产物量减少,则考虑增加镁离子浓度(根据扩增片断长度而定,片段长则相应镁离子浓度应该高一些);
8.若降低退火温度,发现还是只有引物二聚体,而且镁离子的浓度在 20-25mmol/l没有区别,则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀,导致吸取的试剂浓度不对。
9.以上次的pcr产物作模板二次pcr,可以提高引物与模板的特异性,减少引物二聚体,如果两次时间间隔短的话,可以把原产物稀释100-1000倍,如果间隔较长可以稀释50-100倍;
2楼2013-08-23 09:14:39
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Eva2009

禁虫 (初入文坛)

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3楼2013-08-23 11:29:57
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
引用回帖:
3楼: Originally posted by Eva2009 at 2013-08-23 11:29:57
这些俺也在百度上搜过,有没有试过哪种方法啊。。。。怎么让阴性对照里面不出现引物二聚体...

二聚体很严重吗?有一点不影响特异扩增的话不用管它的吧~ 减少引物量,升高退火温度,加镁离子一起用嘛,实在不行重新设计引物呗,没多少钱。
我会绕一个圈,走回到实验室
4楼2013-08-23 12:53:35
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