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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR退火温度的确定
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xuelin1987

铜虫 (小有名气)

[求助] PCR退火温度的确定

各位，我做分子是新手，这两天在做目的引物的退火温度梯度试验，就是确定引物的最佳退火温度，我P出来后的电泳图见附件，我想问的是：在引物2那个图中，我用的是同一个引物，同一个样品模板，为什么P了以后产物不在一条直线上？而是倾斜的？是不是没有P出来啊？还是操作问题？还有就是如果P出来了，那亮度我感觉都差不多，我要选哪个温度作为退火温度啊？是不是我选的温度差距有点小，所以P出来后条带亮度差异不大？呵呵，问题有点多哈，请各位大侠帮帮忙，大恩不言谢啊！
PCR退火温度的确定
引物2温度梯度试验.JPG.JPG
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循序渐进，不懂就问
1楼 2013-08-18 12:02:35
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ykluuniu

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xuelin1987: 金币+1 2013-08-21 15:48:52
首先，跟Marker对比，以确定哪个温度能够扩出你的目的基因。
你的引物多长？你的目的基因多大？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2013-08-18 13:52:35
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ykluuniu

金虫 (小有名气)
条带斜，没关系，只要你把胶放好，不是你认为造成的就可以。不同的退火温度，扩出来的就有可能不一样的大小啊。如果是高保真酶，差别可能大一些，而普通的Taq酶，差别就没那么大。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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xuelin1987
3楼2013-08-18 13:56:39
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15879003030

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+1, 鼓励发帖交流！ 2013-08-18 16:36:53
xuelin1987: 金币+3 2013-08-21 15:52:26
楼主你仔细看你不觉得marker本身也有点歪么？ 说明是跑电泳的问题不是产物大小不一样。可能电泳槽左右两边电压大小不平衡。具体一点可能是有杂物或者铂金丝歪了。
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4楼2013-08-18 15:43:45
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xuelin1987

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ykluuniu at 2013-08-18 13:52:35
首先，跟Marker对比，以确定哪个温度能够扩出你的目的基因。
你的引物多长？你的目的基因多大？

我的引物是203bp。
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循序渐进，不懂就问
5楼2013-08-21 15:50:34
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xuelin1987

铜虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by ykluuniu at 2013-08-18 13:56:39
条带斜，没关系，只要你把胶放好，不是你认为造成的就可以。不同的退火温度，扩出来的就有可能不一样的大小啊。如果是高保真酶，差别可能大一些，而普通的Taq酶，差别就没那么大。
...

哦，好的，我知道了，谢谢！
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循序渐进，不懂就问
6楼2013-08-21 15:51:29
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xuelin1987

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 15879003030 at 2013-08-18 15:43:45
楼主你仔细看你不觉得marker本身也有点歪么？ 说明是跑电泳的问题不是产物大小不一样。可能电泳槽左右两边电压大小不平衡。具体一点可能是有杂物或者铂金丝歪了。

好的，我又做了一遍没有斜了，呵呵，估计是我放歪了！谢谢啊!
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循序渐进，不懂就问
7楼2013-08-21 15:53:19
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阿贾阿贾

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

一个小建议：以后跑胶时，两端都点上marker,就可以看出是跑胶的问题还是产物的问题了。
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8楼2013-12-08 10:31:46
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