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nothaao

铜虫 (小有名气)

[求助] 考马斯亮蓝法测蛋白质

今天做了标准曲线,空白值得吸光度偏高,达到1.356,100mg/L的,加乙醇和酒精配的,配考马斯亮蓝的时候感觉颜色就比较深,是深蓝色,正常吗?线性一般,两个9,我就是觉得吸光度太高了,去掉空白的吸光度正常,怎么回事呢,
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nothaao

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by lovezxl3606 at 2013-08-15 14:42:58
感觉你的蛋白的标准浓度大了,那么点考马斯亮蓝早就饱和了,你可以把蛋白浓度稀释一个梯度看看···

再问下,那我的空白非常高是为什么那
4楼2013-08-15 15:00:32
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查看全部 19 个回答

nothaao

铜虫 (小有名气)

具体过程是这样做的,我写出来吧,方便大家给我找毛病,是用分光光度计在595nm处测得,用的石英比色皿
取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 95%乙醇,加入100mL  85%磷酸,我看我的磷酸是优级纯,没写百分含量,应该是100%吧,所以我加了85mL,定容到1L
颜色比较深,所以空白高,
取0.01G牛血清蛋白,溶解后定容到100mL
标曲加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1mL标准溶液,补充水位1mL,加入考马斯亮蓝5mL,混合,放置5MIN,在595NM测吸光度,我的吸光值分别为1.356,1.446,1.502,1.613,1.728,1.743
我是不是应该少加些考马斯亮蓝了,多加些标准溶液?各位大侠指导下撒
2楼2013-08-15 12:02:04
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lovezxl3606

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-08-15 16:55:13
感觉你的蛋白的标准浓度大了,那么点考马斯亮蓝早就饱和了,你可以把蛋白浓度稀释一个梯度看看···
会当凌绝顶,一览众山小
3楼2013-08-15 14:42:58
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lovezxl3606

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-11-23 14:24:33
用空白矫零的啊,怎么会空白的很高呢?空白的应该是0啊···你是用的什么分光光度计?一般的这类仪器读数要维持在0.2--0.8之间最好,这个是设计的精确度要求···
会当凌绝顶,一览众山小
5楼2013-08-16 08:55:11
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