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黑白VS兔子

木虫 (著名写手)

[求助] SDS-PAGE 跑胶 为什么出来的胶带这么不好啊，请大家指教 可能是什么原因

SDS-PAGE 跑胶 为什么出来的胶带这么不好啊，请大家指教 可能是什么原因！谢谢！
SDS-PAGE 跑胶 为什么出来的胶带这么不好啊，请大家指教 可能是什么原因
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SDS-PAGE 跑胶 为什么出来的胶带这么不好啊，请大家指教 可能是什么原因-1
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1楼 2013-08-11 09:54:14
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黑白VS兔子

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by Gloria001 at 2013-08-11 10:39:21
SDS-PAGE胶是自己制的吗？先看看各个溶液的配方是否正确，凝胶凝固是否充分，样品是否完全溶解，如果检查下来都没有问题，还是跑成这样，建议买块预制胶跑一下试试看。

恩 谢谢！
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7楼2013-08-11 10:53:47
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雪花旋律

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-12 17:04:02
黑白VS兔子: 金币+5, ★有帮助, 分金币啦嘿嘿 2013-09-13 08:47:45
这是跑的什么啊？？蛋白质么？？……是不是杂质太多了啊……感觉都成放射状扩散了怎么？样品搅拌均匀了吗？？……

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2楼2013-08-11 10:15:00
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黑白VS兔子

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 雪花旋律 at 2013-08-11 10:15:00
这是跑的什么啊？？蛋白质么？？……是不是杂质太多了啊……感觉都成放射状扩散了怎么？样品搅拌均匀了吗？？……

我跑的是制备的纳米材料， 样品搅拌还可以吧   俺就是想知道这个  为啥成了这种形状。  浓缩胶压成一条带是什么意思啊？我这个实验一共只用了2h，其中也没见成带状的时候，而且浓缩胶跟分离胶所用的电压是一样的。第一次做，没啥经验！还请指教啊！
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3楼2013-08-11 10:24:53
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黑白VS兔子

木虫 (著名写手)
⒈ 配胶缓冲液系统对电泳的影响？ 　　在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。 　　所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素，当然其他的因素也可以从多方面考虑。 　　⒉ 样品如何处理？ 　　根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。 　　1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。 　　2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。 　　3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。 　　⒊ SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？ 　　聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关； 　　制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，TEMED与AP：AP 催化剂，催化单丙和双丙聚合成聚丙烯酰胺。TEMED 四甲基乙二胺，催凝剂，加速AP 催化作用；十二烷基磺酸钠（SDS）：阴离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。 　　⒋ 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？ 　　聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。 　　一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。 　　⒌“ 微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？ 　　主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。 　　处理办法：待其充分凝固再作后续实验。 　　⒍ “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？ 　　主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。 　　处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。 　　⒎ 为什么带出现拖尾现象？ 　　主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。 　　处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。 　　⒏ 为什么带出现纹理现象？ 　　主要是样品不溶性颗粒引起的。 　　处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。 　　⒐ 什么是“鬼带”，如何处理？ 　　“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。 　　处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。 　　⒑ 为什么溴酚蓝不能起到指示作用？ 　　我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。 　　处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。 　　⒒ 为什么电泳的条带很粗？ 　　电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。 　　处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确(6.7）；适当降低电压； 　　⒓ 为什么电泳电压很高而电流却很低呢？ 　　这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。 　　处理办法：电泳槽正确装配即可。 　　⒔ 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？ 　　这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。 　　⒕ 凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？ 　　通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。 　　⒖ 电泳时间比正常要长？ 　　可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。 　　⒗分离胶加上后为什么要立即加水？ 　　加入分离胶后，立即覆一层双蒸水，一是为了使分离胶界面保持水平，用水就可以把它压平，使蛋白质分子跑时在同一水平线上；二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。 　　⒘连续分离胶体系配制（凝胶板厚度0.75mm，长度10cm）100ml体系：双蒸水37.5ml 　　尿 素20--50g 　　10×TBE缓冲液8ml 　　30%丙烯酰胺10ml 　　AP（过硫酸铵）500--800ul [注：现配现用] 　　TEMED（四甲基乙二胺） 23.5ul
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4楼2013-08-11 10:34:35
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