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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR产物平末端化问题
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574759350

铁虫 (小有名气)

[求助] PCR产物平末端化问题 已有2人参与

我要做PCR产物和载体一个平末端一个粘性末端的连接，先将PCR产物用T4 DNA聚合酶削去A尾，然后再用另一个内切酶切割，实现一个平端一个粘性末端，现在有一个问题是T4 DNA聚合酶处理平端之后还要不要胶回收再用另一个内切酶切割，如果胶回收的话可能浓度就很低了，因为实验中一共进行好几次回收，如果不回收的话又怕前一步的反应影响后续实验，大家有没有做过的？给个建议
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1楼 2013-08-06 11:24:03
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ytetyio09

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-03-26 09:50:55
可以试试这篇论文的方法，虽然是个小的改进，但是值得一试，而且很方便：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24613256
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5楼2014-03-25 18:58:50
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
574759350: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-08-06 22:10:17
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-08 20:17:46
要先胶回收再用另一个内切酶切割，否则影响活力或者导致星号活力；还有一个方法就是直接PCR cleanup 回收然后用另一个内切酶酶切处理，方便，但是也会影响收率。
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2楼2013-08-06 11:37:54
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574759350

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lxj341401 at 2013-08-06 11:37:54
要先胶回收再用另一个内切酶切割，否则影响活力或者导致星号活力；还有一个方法就是直接PCR cleanup 回收然后用另一个内切酶酶切处理，方便，但是也会影响收率。

您好，请教个问题，我提取的质粒做了一个单酶切，但是没有完全切开，还存在部分非线性的质粒，但我后续实验需要的是线性的，按理说应该要电泳切胶回收，但是因为我的载体比较大，回收效率低，所以想着能不能先将酶切的质粒电泳，之后将目的条带切下来，然后加入酚氯仿抽提乙醇沉淀？这种效果好不好
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3楼2013-10-08 15:55:53
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-03-26 09:50:52
引用回帖:
3楼: Originally posted by 574759350 at 2013-10-08 15:55:53
您好，请教个问题，我提取的质粒做了一个单酶切，但是没有完全切开，还存在部分非线性的质粒，但我后续实验需要的是线性的，按理说应该要电泳切胶回收，但是因为我的载体比较大，回收效率低，所以想着能不能先将酶 ...

可以的，酚氯仿抽提乙醇沉淀回收DNA效果也挺好的，注意少切点胶，沉淀的时候-80或-20度低温处理。
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4楼2013-10-09 15:29:51
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