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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » ni柱纯化问题
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鸡鸣不已

铜虫 (正式写手)

[求助] ni柱纯化问题 已有1人参与

大家好，我最近用金斯瑞的Ni柱纯化我的蛋白（带His6），上样过程会穿过挺多，吸附也较弱（说明书上的缓冲液
Lysis  Equilibration Buffer (LE buffer):   50 mM NaH 2 PO4,   300  mM NaCl, pH  8.0 
Wash  Buffer:    50 mM NaH 2 PO4, 300  mM NaCl, 10 mM imidazole,   pH  8.0 
Elution  buffer:   50 mM NaH 2 PO4, 300  mM  NaCl,  250  mM imidazole, pH 8.0 
就是用10mM咪唑洗杂，我用10mM咪唑基本洗脱了），想问大家，Ni柱有哪些上样方式，可以把柱材和我样品混匀过夜，第二天装柱吗？大家平时还用什么缓冲液效果好，谢谢大家
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1楼 2013-08-06 11:13:16
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xuexie

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
鸡鸣不已(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2013-08-14 13:15:40
鸡鸣不已: 金币+15, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-08-14 14:48:57
我做的也是金斯瑞的镍柱，用的是0.02M Tris-Hcl+0.25M Nacl平衡后高盐除杂。同学也遇到过一样不挂柱的问题，重复几次后怀疑是由于HIS标签被蛋白包裹，没有暴露，所以无法充分挂柱。你可以用1.5mlEP管，装一些填料在柱下试验，同样用缓冲液平衡后上样，充分混匀后离心，再用EDTA洗脱，这样试验会节省时间。希望对你有帮助
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9楼2013-08-12 16:15:29
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zhang1zheng2

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
鸡鸣不已: 金币+5, ★有帮助, TKS 2013-08-07 20:33:02
NI柱旧了吧， 再生后试了么？
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手握日月摘星辰，看透生死破凡尘
2楼2013-08-06 11:19:33
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鸡鸣不已

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhang1zheng2 at 2013-08-06 11:19:33
NI柱旧了吧， 再生后试了么？

再生了，还是有穿过，且低浓度咪唑就部分洗下来了。柱子柱材有3.5ml左右，按说明书上每1ml可吸附20mg蛋白，应该完全可以吸附的呀。你说我可以将柱材和样品混匀颠倒过夜，第二天再装柱吗，谢谢
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3楼2013-08-06 15:23:34
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zhang1zheng2

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 鸡鸣不已 at 2013-08-06 15:23:34
再生了，还是有穿过，且低浓度咪唑就部分洗下来了。柱子柱材有3.5ml左右，按说明书上每1ml可吸附20mg蛋白，应该完全可以吸附的呀。你说我可以将柱材和样品混匀颠倒过夜，第二天再装柱吗，谢谢...

对不起，没试过，只能说：可能吧。
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手握日月摘星辰，看透生死破凡尘
4楼2013-08-06 15:30:02
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