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ni柱纯化问题 已有1人参与
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大家好，我最近用金斯瑞的Ni柱纯化我的蛋白（带His6），上样过程会穿过挺多，吸附也较弱（说明书上的缓冲液 Lysis Equilibration Buffer (LE buffer): 50 mM NaH 2 PO4, 300 mM NaCl, pH 8.0 Wash Buffer: 50 mM NaH 2 PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0 Elution buffer: 50 mM NaH 2 PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0 就是用10mM咪唑洗杂，我用10mM咪唑基本洗脱了），想问大家，Ni柱有哪些上样方式，可以把柱材和我样品混匀过夜，第二天装柱吗？大家平时还用什么缓冲液效果好，谢谢大家 |
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 蛋白质生物学实验经验 |
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25楼2013-08-15 16:36:48
zhang1zheng2
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2楼2013-08-06 11:19:33
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4楼2013-08-06 15:30:02
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7楼2013-08-06 21:03:24
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你可以试一下降低氯化钠浓度，我过NI的时候是用20mM Tris-HCl 150mM NaCl平衡的 每1ml可吸附20mg蛋白，这个不一定，而且要看总蛋白，你可以试一下你的离子柱下样后的样品再蛋白质核酸检测器的吸收值，然后上Q柱子，当流穿的显示值是离子下样的一半的时候换平衡液，这样可以大概测一下Ni对你的蛋白的载量。 至于柱材和我样品混匀过夜个人觉得没有什么意义，应该一样的，不会因为这个时间长结合牢固 |
8楼2013-08-06 23:19:43
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| 我做的也是金斯瑞的镍柱，用的是0.02M Tris-Hcl+0.25M Nacl平衡后高盐除杂。同学也遇到过一样不挂柱的问题，重复几次后怀疑是由于HIS标签被蛋白包裹，没有暴露，所以无法充分挂柱。你可以用1.5mlEP管，装一些填料在柱下试验，同样用缓冲液平衡后上样，充分混匀后离心，再用EDTA洗脱，这样试验会节省时间。希望对你有帮助 |
9楼2013-08-12 16:15:29
10楼2013-08-14 11:17:40
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