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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » ni柱纯化问题
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鸡鸣不已

铜虫 (正式写手)

[求助] ni柱纯化问题 已有1人参与

大家好，我最近用金斯瑞的Ni柱纯化我的蛋白（带His6），上样过程会穿过挺多，吸附也较弱（说明书上的缓冲液
Lysis  Equilibration Buffer (LE buffer):   50 mM NaH 2 PO4,   300  mM NaCl, pH  8.0 
Wash  Buffer:    50 mM NaH 2 PO4, 300  mM NaCl, 10 mM imidazole,   pH  8.0 
Elution  buffer:   50 mM NaH 2 PO4, 300  mM  NaCl,  250  mM imidazole, pH 8.0 
就是用10mM咪唑洗杂，我用10mM咪唑基本洗脱了），想问大家，Ni柱有哪些上样方式，可以把柱材和我样品混匀过夜，第二天装柱吗？大家平时还用什么缓冲液效果好，谢谢大家
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1楼 2013-08-06 11:13:16
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

鸡鸣不已

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
24楼: Originally posted by 929519755 at 2013-08-15 11:05:15
可以啊  告诉你怎么弄
用20mM咪唑漂洗25ml 收集样品，只用收集三管，分别从开始、中间、和结束时收集。
用30mM咪唑漂洗25ml 收集样品，只用收集三管，分别从开始、中间、和结束时收集。
用40mM咪唑漂洗6mL收集样 ...

我的意思是用梯度混合器
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25楼2013-08-15 16:36:48
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普通回帖

zhang1zheng2

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
鸡鸣不已: 金币+5, ★有帮助, TKS 2013-08-07 20:33:02
NI柱旧了吧， 再生后试了么？
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手握日月摘星辰，看透生死破凡尘
2楼2013-08-06 11:19:33
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鸡鸣不已

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhang1zheng2 at 2013-08-06 11:19:33
NI柱旧了吧， 再生后试了么？

再生了，还是有穿过，且低浓度咪唑就部分洗下来了。柱子柱材有3.5ml左右，按说明书上每1ml可吸附20mg蛋白，应该完全可以吸附的呀。你说我可以将柱材和样品混匀颠倒过夜，第二天再装柱吗，谢谢
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3楼2013-08-06 15:23:34
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zhang1zheng2

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 鸡鸣不已 at 2013-08-06 15:23:34
再生了，还是有穿过，且低浓度咪唑就部分洗下来了。柱子柱材有3.5ml左右，按说明书上每1ml可吸附20mg蛋白，应该完全可以吸附的呀。你说我可以将柱材和样品混匀颠倒过夜，第二天再装柱吗，谢谢...

对不起，没试过，只能说：可能吧。
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手握日月摘星辰，看透生死破凡尘
4楼2013-08-06 15:30:02
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
鸡鸣不已: 金币+10, ★有帮助, TKS 2013-08-07 20:33:21
似乎楼主是在让蛋白变性的情况下做的, 出现这个问题很大可能是因为蛋白折叠使得His标签不能充分暴露造成的.
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5楼2013-08-06 15:57:26
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鸡鸣不已

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-08-06 15:57:26
似乎楼主是在让蛋白变性的情况下做的, 出现这个问题很大可能是因为蛋白折叠使得His标签不能充分暴露造成的.

没有变性，先过阴离子柱（Q sephrose fast flow),再过Ni柱
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6楼2013-08-06 20:39:43
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bullfrog325

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 鸡鸣不已 at 2013-08-06 20:39:43
没有变性，先过阴离子柱（Q sephrose fast flow),再过Ni柱...

我前半句说意思说反了......对不住啊
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7楼2013-08-06 21:03:24
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wight3

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-07 09:16:42
鸡鸣不已: 金币+30, ★★★★★最佳答案, 谢谢，我再看看 2013-08-07 20:31:40
gyesang: 回帖置顶 2013-08-14 13:15:29
你可以试一下降低氯化钠浓度，我过NI的时候是用20mM Tris-HCl 150mM NaCl平衡的
每1ml可吸附20mg蛋白，这个不一定，而且要看总蛋白，你可以试一下你的离子柱下样后的样品再蛋白质核酸检测器的吸收值，然后上Q柱子，当流穿的显示值是离子下样的一半的时候换平衡液，这样可以大概测一下Ni对你的蛋白的载量。
至于柱材和我样品混匀过夜个人觉得没有什么意义，应该一样的，不会因为这个时间长结合牢固
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8楼2013-08-06 23:19:43
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xuexie

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
鸡鸣不已(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2013-08-14 13:15:40
鸡鸣不已: 金币+15, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-08-14 14:48:57
我做的也是金斯瑞的镍柱，用的是0.02M Tris-Hcl+0.25M Nacl平衡后高盐除杂。同学也遇到过一样不挂柱的问题，重复几次后怀疑是由于HIS标签被蛋白包裹，没有暴露，所以无法充分挂柱。你可以用1.5mlEP管，装一些填料在柱下试验，同样用缓冲液平衡后上样，充分混匀后离心，再用EDTA洗脱，这样试验会节省时间。希望对你有帮助
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9楼2013-08-12 16:15:29
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鸡鸣不已

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by xuexie at 2013-08-12 16:15:29
我做的也是金斯瑞的镍柱，用的是0.02M Tris-Hcl+0.25M Nacl平衡后高盐除杂。同学也遇到过一样不挂柱的问题，重复几次后怀疑是由于HIS标签被蛋白包裹，没有暴露，所以无法充分挂柱。你可以用1.5mlEP管，装一些填料在 ...

EDTA洗脱，咪唑吧？你用的是Ni-NTA？
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10楼2013-08-14 11:17:40
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