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Jianxiao_H

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[求助] PCR引物设计问题。

总是得不到想要的引物，我需要tm值在60°C的引物。
像我下图这样弄可以么，引物中有一小段序列不与模板链配对。
或者为了保证tm值，在3‘末端加上一个与模板链配对的碱基。

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多少辛酸不可告人。

1楼 2013-08-01 19:18:16

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Jianxiao_H

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我顶。

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多少辛酸不可告人。

2楼2013-08-01 21:11:40

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Sthunder

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Jianxiao_H(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-01 22:32:18

不知道LZ设计引物的目的是做什么。设计引物的时候3端一定要与模板完全配对，如果你中间有不配对碱基，那么你的有效引物就应该是3端到最后一个连续与模板配对的碱基这一段序列。PS，如果要P特异长度片段，那么5端就定了，但你可以通过延长or缩短3端来调节Tm，上下游Tm差异最后控制在4度以内，不过6度一般都没问题，我做过最大相差10度的！~ Good luck！

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互助互励，共奋共进！！

3楼2013-08-01 21:48:31

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Jianxiao_H

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引用回帖:

3楼: Originally posted by Sthunder at 2013-08-01 21:48:31
不知道LZ设计引物的目的是做什么。设计引物的时候3端一定要与模板完全配对，如果你中间有不配对碱基，那么你的有效引物就应该是3端到最后一个连续与模板配对的碱基这一段序列。PS，如果要P特异长度片段，那么5端就 ...

用来做荧光定量pcr的，因此产物不需要太长，最多也就300bp，但我心会不会对特异性有影响。
我需要跟内参基因引物tm一样才行，内参的在60°C这样。
谢谢你的经验，很有用。

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多少辛酸不可告人。

4楼2013-08-01 22:40:50

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