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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR引物设计问题。
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Jianxiao_H

金虫 (正式写手)

[求助] PCR引物设计问题。

总是得不到想要的引物，我需要tm值在60°C的引物。
像我下图这样弄可以么，引物中有一小段序列不与模板链配对。
或者为了保证tm值，在3‘末端加上一个与模板链配对的碱基。
PCR引物设计问题。
4IA9OLXI`2AS]A7L`Q6B_IC.jpg
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多少辛酸不可告人。
1楼 2013-08-01 19:18:16
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Jianxiao_H

金虫 (正式写手)
我顶。
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多少辛酸不可告人。
2楼2013-08-01 21:11:40
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Jianxiao_H(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-01 22:32:18
不知道LZ设计引物的目的是做什么。设计引物的时候3端一定要与模板完全配对，如果你中间有不配对碱基，那么你的有效引物就应该是3端到最后一个连续与模板配对的碱基这一段序列。PS， 如果要P特异长度片段，那么5端就定了，但你可以通过延长or缩短3端来调节Tm，上下游Tm差异最后控制在4度以内，不过6度一般都没问题，我做过最大相差10度的！~ Good luck！
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互助互励，共奋共进！！
3楼2013-08-01 21:48:31
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Jianxiao_H

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Sthunder at 2013-08-01 21:48:31
不知道LZ设计引物的目的是做什么。设计引物的时候3端一定要与模板完全配对，如果你中间有不配对碱基，那么你的有效引物就应该是3端到最后一个连续与模板配对的碱基这一段序列。PS， 如果要P特异长度片段，那么5端就 ...

用来做荧光定量pcr的，因此产物不需要太长，最多也就300bp，但我心会不会对特异性有影响。
我需要跟内参基因引物tm一样才行，内参的在60°C这样。
谢谢你的经验，很有用。
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多少辛酸不可告人。
4楼2013-08-01 22:40:50
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丹丹317

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我设计引物的时候不知道为什么也总是退火温度不是很高，用软件设计和在线设计都不是很理想
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fighting
5楼2013-08-05 10:12:37
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Jianxiao_H

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 丹丹317 at 2013-08-05 10:12:37
我设计引物的时候不知道为什么也总是退火温度不是很高，用软件设计和在线设计都不是很理想

我感觉gc值和bp数还是对tm有影响的，tm不够的时候我就挪一下引物位置，就差不多了。
btw，你用什么软件设计引物啊？
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多少辛酸不可告人。
6楼2013-08-05 10:49:12
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 丹丹317 at 2013-08-05 10:12:37
我设计引物的时候不知道为什么也总是退火温度不是很高，用软件设计和在线设计都不是很理想

退火温度跟引物的GC含量和长度有关，一般引物20bp的话GC含量50%-60%的话，Tm值62度左右，Tm值也有不同的计算公式，这个也不好说谁高谁低
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
7楼2013-08-05 13:33:20
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