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761429495

新虫 (小有名气)

[求助] 重叠延伸PCR

各位大侠:
我要做三个片段进行重叠延伸PCR将他们连接起来成一个长片段,引物该如何设计?长度应该是多少?
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gyesang

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761429495(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你的更多精彩,gy版热心肠 2013-07-25 23:26:08
三个片段,假设是A,B,C,设计引物是AB有一段overlap,BC有一段overlap,overlap我做过最短18bp的,一般25bp,基因特异引物就是普通的设计方法,跑PCR时,AB fusion,BCfusion,然后跑胶回收,将AB 和BC一起跑,这个描述起来,对我来说很复杂,谅解哈
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-07-25 16:09:18
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史前五百年

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
这方面文献横多的,楼主可以找些看看,2楼说的经典。就是这个意思。
3楼2013-07-26 10:13:50
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huoyongting

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
其实也没必要两两混合,我最近做过几个都是十几条长引物混到一起扩的,都做出来了,为了省钱,全基因合成还是太贵了
4楼2013-07-26 15:19:44
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王者归来001

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
2楼说的很好,可以去网上看看overlap-pcr引物设计时的要求及特点就好了,都能很顺利的连接上
坚持不懈,终会成功!
5楼2013-07-26 16:55:01
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gyesang

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【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by huoyongting at 2013-07-26 15:19:44
其实也没必要两两混合,我最近做过几个都是十几条长引物混到一起扩的,都做出来了,为了省钱,全基因合成还是太贵了

这个还是要取决她融合基因的长度,如果要融合几K的话,合成引物回来混一起扩增,还是蛮费钱的,都差不多吧,除了基因合成,都得做PCR,就看哪个可靠和稳定
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
6楼2013-07-26 17:19:23
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huoyongting

金虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by gyesang at 2013-07-26 17:19:23
这个还是要取决她融合基因的长度,如果要融合几K的话,合成引物回来混一起扩增,还是蛮费钱的,都差不多吧,除了基因合成,都得做PCR,就看哪个可靠和稳定...

他已经有3个片段作为模板了,当然就不用合那么多条引物了,6条就够了,呵呵
7楼2013-07-26 17:30:09
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