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lxyyzz

木虫 (小有名气)

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[求助] 求助分子克隆问题——挑不出阳性克隆！已有1人参与

分子克隆两个酶切位点是AgeI和XhoI，酶切6h后回收。
载体跑胶，看到的切割条带和预想的一样，8000bp和2000bp，选取8000bp的条带切胶回收。载体和片段回收后也跑过胶，大小位置都是对的。做了好几次都没有阳性克隆，长出的克隆都没有插入片段。

后来我只取了回收后的载体，同样加入连接酶连接转化后，发现板上也长了克隆！大概十几个左右的样子。我很不理解，按照道理说回收后的载体是线性的，并带有两个不同的粘性末端，应该不会再成环啊，为什么还能长的出克隆呢？

请高人帮忙解释下，给点建议！我是真不知道这种情况该怎么办了。

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1楼 2013-06-22 14:08:06

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木虫 (著名写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-07-10 16:40:06
lxyyzz: 金币+8, ★有帮助, 谢谢！载体酶切能清楚看到有两条带，和预期一样，两个酶应该都发挥作用了。其他几点我再去改进改进~ 2013-07-10 22:57:12

如果插入片段是PCR得到的，而不是从载体切割的，很大可能是酶切效果不好，有可能是因为保护碱基不够长，也可能是因为酶切体系活性不够强。
另外，载体双酶切也去磷酸化更保险，除非载体单酶切跟双酶切得到的载体片段有明显差别，否则不能排除只切开一个位点，那样胶回收再连接就很可能自身环化了。
还有就是感受态细胞的问题。