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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助分子克隆问题——挑不出阳性克隆！
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lxyyzz

木虫 (小有名气)

[求助] 求助分子克隆问题——挑不出阳性克隆！ 已有1人参与

分子克隆两个酶切位点是AgeI和XhoI，酶切6h后回收。
载体跑胶，看到的切割条带和预想的一样，8000bp和2000bp，选取8000bp的条带切胶回收。载体和片段回收后也跑过胶，大小位置都是对的。做了好几次都没有阳性克隆，长出的克隆都没有插入片段。

后来我只取了回收后的载体，同样加入连接酶连接转化后，发现板上也长了克隆！大概十几个左右的样子。我很不理解，按照道理说回收后的载体是线性的，并带有两个不同的粘性末端，应该不会再成环啊，为什么还能长的出克隆呢？

请高人帮忙解释下，给点建议！我是真不知道这种情况该怎么办了。
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1楼 2013-06-22 14:08:06
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

8000和没切完全的1W跑胶分不开吧，长出来的可能是没切的（你有提出来切下试试么？），纯得粘性末端线性片段基本上不会连接转化的
至于没有阳性，只能你自己检查下实验步骤和体系了，比如连接有没有问题什么的。
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10楼2013-07-11 00:50:09
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zhsha1993

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
lxyyzz: 金币+5, ★有帮助, 就是酶切后用试剂盒回收，然后跑胶看看回收的片段大小对不对。。 2013-07-10 22:51:18
“载体和片段回收后也跑过胶” 这句话如何解？
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2楼2013-07-10 09:59:14
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zhsha1993

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

你最好把你的质粒图谱发来看看。
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3楼2013-07-10 10:07:24
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longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励新虫交流 2013-07-10 10:10:09
lxyyzz: 金币+5, ★有帮助, 线性的两端粘性末端都不一样啊，这样也能自连？ 2013-07-10 22:52:16
你所不理解的很正常：线性它也可能再重新自连的哇。
没有阳性克隆，载体上没有插入的片段那可能就是是你连接效率低，长出来的克隆都是自连的。
你看蓝白斑筛选的时候不是一样会长很多非阳性克隆么。
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伟大航线....
4楼2013-07-10 10:09:05
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