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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » DGGE 条带p不出来
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leeyuese

新虫 (小有名气)

[求助] DGGE 条带p不出来

DGGE 后的条带p不出来，模板为30微灭菌水浸泡24h，后-20度保存了几个月
引物为 968F 和 1401
体系25微
     buffer  2.5
        dntp     2.5
        1401   0.5
        968F   0.5
       Ex taq  0.5
       模板   2.5
       水     16
条件：94    4min   
          94    30s
          68   30s
          72   30s
          72   10min
          4        ----    共35个循环，结果就是p不出来，怎么办
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1楼 2013-06-06 14:54:14
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lhf903

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
退火温度是不是太高了，降低试试~
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2楼2013-06-06 16:52:36
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xiadongliang

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
68度   30s 确实很高。
我都用55度。
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3楼2013-06-07 09:11:45
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leeyuese

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xiadongliang at 2013-06-07 09:11:45
68度   30s 确实很高。
我都用55度。

我温度梯度也做了，50 55 58 60 都不行
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4楼2013-06-08 08:09:15
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xuehm2012

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 欢迎交流 2013-06-08 15:28:08
我问一下，我要做16s rDNA V3 区扩增，然后跑DGGE, 我看到有的文献里面提取完DNA后先做16s rDNA的扩增，然后再扩增V3 区，这样做的原因是什么，扩增效果会更好吗？
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5楼2013-06-08 08:45:15
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xiadongliang

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
1949stone: 金币+1, 鼓励分享经验 2013-06-08 15:28:40
引用回帖:
4楼: Originally posted by leeyuese at 2013-06-08 08:09:15
我温度梯度也做了，50 55 58 60 都不行...

那可能是你的模板里面的析出盐成分可能过高了或者DNA降解，导致扩增无法成功。

我以前也有这样的情况，头一天回收的胶，第二天做成功率很高过几天再做，就比较低了。
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6楼2013-06-08 09:32:02
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xiaomo6511

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+1, 一般不会 2013-06-08 15:29:19
有没有可能是模版量太少
要不要考虑做个巢式试试
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7楼2013-06-08 11:06:35
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leeyuese

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by xiadongliang at 2013-06-08 09:32:02
那可能是你的模板里面的析出盐成分可能过高了或者DNA降解，导致扩增无法成功。

我以前也有这样的情况，头一天回收的胶，第二天做成功率很高过几天再做，就比较低了。...

还有请他办法挽回吗？我想在重做DGGE了，样品没了
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8楼2013-06-09 10:11:09
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