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惟我独尊

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】有做DGGE的虫友们来帮帮忙啊 已有3人参与

本人正DGGE几个月了 经历了艰难险阻终于到了切胶回收测序这一步了。呵呵 ,请问大家做DGGE的切胶回收步骤都是怎么做的 啊?有没有专门的DGGE胶回收试剂盒啊,我知道有卖琼脂糖和聚丙烯酰胺胶回收试剂盒的 , 能用来做DGGE胶回收吗?如果没有试剂盒,大家都是怎么做的啊 ,谢谢指导啊。期待中。。。。
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526378054

金虫 (小有名气)


amisking(金币+1):欢迎分享经验! 2010-08-23 21:01:15
惟我独尊(金币+2):谢谢你的及时回复 2010-08-27 10:46:05
我们实验室就是没有胶回收试剂盒,我们一般用枪头切胶,于TE中过夜,第二天做PCR(带GC夹子的引物),然后再DGGE检验是否纯带,若纯就再次PCR(不带GC夹子),这样就可以把PCR产物送去测序了
2楼2010-08-23 17:37:43
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惟我独尊

金虫 (小有名气)

谢谢楼上的帮助,再弱弱的问一句:你们最初做DGGE的上样DNA样品的PCR引物也用的带GC夹子的吗,我的没用 会有很大影响吗?
3楼2010-08-23 23:04:40
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526378054

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 惟我独尊 at 2010-08-23 23:04:40:
谢谢楼上的帮助,再弱弱的问一句:你们最初做DGGE的上样DNA样品的PCR引物也用的带GC夹子的吗,我的没用 会有很大影响吗?

做DGGE上样用的PCR都要用GC夹子吧!不用的话是做不出来的!
4楼2010-08-24 11:45:08
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jndxmmc

新虫 (小有名气)


silicare(金币+1):鼓励交流 2010-08-25 12:13:46
惟我独尊(金币+1):谢谢 2010-08-27 10:46:43
用小刀在在紫外下直接割胶于TE中过夜,第二天 60度温浴,做PCR(带GC夹子),再DGGE检验是否单挑带,如果是,重复割胶回收,用不带GC的引物PCR,PCR产物送去测序
5楼2010-08-25 10:07:43
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crydevil

金虫 (小有名气)

惟我独尊(金币+1): 2010-08-27 10:46:53
我是切下来之后放入无菌水 轻轻捣碎胶块,然后在冰箱中反复冻融几次,第二天以上清液做模板P就好了。很简单的
6楼2010-08-25 14:00:45
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惟我独尊

金虫 (小有名气)

嘿嘿 知道了 谢谢大家的帮助啊
:
7楼2010-08-27 10:45:13
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惟我独尊

金虫 (小有名气)

还有 如果第二次做DGGE发现不是一条带怎么办?要把第二次的多条带都割胶PCR测序?
8楼2010-08-27 10:48:16
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crydevil

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 惟我独尊 at 2010-08-27 10:48:16:
还有 如果第二次做DGGE发现不是一条带怎么办?要把第二次的多条带都割胶PCR测序?

那就反复做P 直到分出单一条带
9楼2010-08-28 09:30:50
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惟我独尊

金虫 (小有名气)

染色问题

继续请教大家一下,大家都是用什么染色方法啊,银染?EB还是SYBRGree1?银染比较简单,不用成像,但好像有的文献说银染后不能用于割胶测序是这样的ma ?
10楼2010-08-30 11:15:22
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