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kikiwitch

新虫 (初入文坛)

[交流] SDS-PAGE跑膜蛋白为什么会这样 已有3人参与

第一次跑膜蛋白,用的是TRITON 来溶解的,用的是10%的胶,为什么感觉大部分蛋白都挤在上部分了。

另外,因为我要检测的是cytochrome,细胞色素在菌体的的表达,所以用专门的方法染了一下细胞色素,见下图,从左到右2,4两条是我的sample,其他是control(没有转质粒进去的野生菌株),感觉确实蓝色条带加深了,但都挤在了胶最上方,不知道为什么。

新手发帖,没有金币悬赏,实在抱歉啊。
SDS-PAGE跑膜蛋白为什么会这样
SDS.jpg


SDS-PAGE跑膜蛋白为什么会这样-1
heme staining.jpg

[ Last edited by kikiwitch on 2013-5-23 at 16:28 ]
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edoz1986

新虫 (小有名气)


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引用回帖:
7楼: Originally posted by lzjessie_wlf at 2013-05-23 21:39:57
怎么去除去污剂呀。...

用普通buffer洗柱子就好了啊
8楼2013-05-23 22:04:11
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edoz1986

新虫 (小有名气)

★ ★
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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-23 18:47:08
你的膜蛋白应该没有提取出来,还是在细胞膜上吧!在对膜蛋白进行纯化和纯化的时候,要用去污剂将蛋白与细胞膜进行分离,并在去污剂溶解的状态下进行纯化,纯化后膜蛋除去白去污剂再进行重构。你用的triton应该不能(或很少)提取溶解吧!
2楼2013-05-23 17:12:01
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edoz1986

新虫 (小有名气)

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-23 18:48:02
引用回帖:
2楼: Originally posted by edoz1986 at 2013-05-23 17:12:01
你的膜蛋白应该没有提取出来,还是在细胞膜上吧!在对膜蛋白进行纯化和纯化的时候,要用去污剂将蛋白与细胞膜进行分离,并在去污剂溶解的状态下进行纯化,纯化后膜蛋除去白去污剂再进行重构。你用的triton应该不能( ...

可以用ddm来溶解膜蛋白,你溶解的时候破碎了吗?
3楼2013-05-23 17:25:33
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kikiwitch

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by edoz1986 at 2013-05-23 17:25:33
可以用ddm来溶解膜蛋白,你溶解的时候破碎了吗?...

是的,我先超声将细胞破碎后,用ultracentrifugation方法将上清与膜分开,之后用
5% wt/vol Triton X-100, 50 mM Hepes pH 7.4, 200 mM NaCl 溶液进行溶解。
4楼2013-05-23 17:38:42
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