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776142

金虫 (正式写手)

[交流] DNA电泳图分析求助

跑了很多次从DH5a大肠杆菌中用合成的萃取材料分离出的DNA电泳，总是出现问题，操作是按照碱法裂解的方法配制溶液1,2,3同时在1中加入RNA酶，然后用合成的材料吸附洗脱，但在200处左右总出现很亮的条带，加大RNA酶的浓度也无法解决，并且跑出的DNA条带与试剂盒得到的最亮条带也不在一条直线上，不知道是不是我用1M的NaCl洗脱后的结果，希望明白的朋友们能够帮忙解决下，不尽感激。
DNA电泳图分析求助
图片3.jpg



[ Last edited by 776142 on 2013-5-21 at 10:02 ]
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1楼 2013-05-21 10:00:50
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youngker918

金虫 (正式写手)
★ ★
776142(金币+1): 谢谢参与
776142(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-21 13:18:57
有可能啊，建议你氯化钠洗脱后再做下脱盐
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3楼2013-05-21 10:49:53
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孤城一片

木虫 (小有名气)
★ ★
776142(金币+1): 谢谢参与
776142(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流经验！ 2013-05-22 00:59:58
我以前做的时候也是这样，我一开始也是RNA酶加的量很大，后来我一般是大提，然后做一次回收，效果还行
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6楼2013-05-21 14:04:21
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776142

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by youngker918 at 2013-05-21 10:49:53
有可能啊，建议你氯化钠洗脱后再做下脱盐

能告诉下具体的除盐过程吗，刚接触这一领域不太懂，谢谢。我是用300微升的1M氯化钠洗脱的，
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7楼2013-05-21 14:17:39
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776142

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 孤城一片 at 2013-05-21 14:04:21
我以前做的时候也是这样，我一开始也是RNA酶加的量很大，后来我一般是大提，然后做一次回收，效果还行

下层的东西是RNA吗，如果是的话为什么加RNA酶除不掉呢，在跑电泳的时候，高盐浓度是否会是DNA降解啊，谢谢
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8楼2013-05-21 14:19:15
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yxg_568

木虫 (职业作家)
★
776142(金币+1): 谢谢参与
好高深！
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9楼2013-05-21 14:45:40
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gzl9901

铁杆木虫 (文坛精英)
★
776142(金币+1): 谢谢参与
每天上小木虫，每天搞科研！
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10楼2013-05-21 15:02:12
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jinluzhang

新虫 (初入文坛)
★ ★
776142(金币+1): 谢谢参与
776142(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-22 01:00:09
你试过测一下DNA的260/280吗？我觉得你这个后面100左右那儿的亮带像蛋白，而且你这个图歪歪扭扭的琼脂糖没有充分融好，多煮一会儿。再有你试剂盒提出来怎么有杂带呢？你的样品最好用同一批次培养的大肠杆菌。
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12楼2013-05-21 15:30:39
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776142

金虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by jinluzhang at 2013-05-21 15:30:39
你试过测一下DNA的260/280吗？我觉得你这个后面100左右那儿的亮带像蛋白，而且你这个图歪歪扭扭的琼脂糖没有充分融好，多煮一会儿。再有你试剂盒提出来怎么有杂带呢？你的样品最好用同一批次培养的大肠杆菌。

OD值都2.1了 实在不知道怎么回事了
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13楼2013-05-21 19:25:15
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mcr199301

铜虫 (初入文坛)
★
776142(金币+1): 谢谢参与
最下面那些是引物二聚体吗
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16楼2013-05-21 20:16:54
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sometimess

新虫 (初入文坛)
★
776142(金币+1): 谢谢参与
学习中、
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17楼2013-05-22 09:10:39
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meiting

木虫 (正式写手)
★
776142(金币+1): 谢谢参与
新手上路，看不懂
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18楼2013-05-22 12:33:11
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huoyongting

金虫 (正式写手)
★ ★
776142(金币+1): 谢谢参与
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-27 21:58:29
RNA酶的作用时间可以长一点或者买好一点的RNA酶，然后如果是异丙醇加的量太多的话也会有RNA污染的，跟试剂盒相比的话你的条带大部分是线性化的了，可能是你加二液的时候混匀的过于剧烈了，这个注意下就好了，祝好运
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19楼2013-05-22 15:20:35
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小丑兮兮

铁虫 (初入文坛)
★
776142(金币+1): 谢谢参与
新手，学习中
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20楼2013-05-22 15:52:53
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field0073

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-08-27 22:27:12
引用回帖:
19楼: Originally posted by huoyongting at 2013-05-22 15:20:35
RNA酶的作用时间可以长一点或者买好一点的RNA酶，然后如果是异丙醇加的量太多的话也会有RNA污染的，跟试剂盒相比的话你的条带大部分是线性化的了，可能是你加二液的时候混匀的过于剧烈了，这个注意下就好了，祝好运

200bp的条带应该不是RNA，首先RNA容易降解，图谱中如果是RNA应该很弥散，而不是这么均一（虽然也模糊）；再者，已经用RNA酶处理过，楼上有人说RNA酶可能失活，其实RNA酶很难灭活，并且酶活力较高，所以很有可能不是RNA. 我比较同意16楼说的，可能在提取过程中震荡剧烈导致DNA断裂，并且图片也说明你的目的条带与试剂盒上所给不一致，再次做的时候不要震混，多次颠倒混匀即可。
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22楼2013-05-22 22:32:50
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huoyongting

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
22楼: Originally posted by field0073 at 2013-05-22 22:32:50
200bp的条带应该不是RNA，首先RNA容易降解，图谱中如果是RNA应该很弥散，而不是这么均一（虽然也模糊）；再者，已经用RNA酶处理过，楼上有人说RNA酶可能失活，其实RNA酶很难灭活，并且酶活力较高，所以很有可能不是 ...

16楼说的是引物二聚体，引物哪里来的，而且条带明显在200以下
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23楼2013-05-23 08:17:15
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776142

金虫 (正式写手)
引用回帖:
22楼: Originally posted by field0073 at 2013-05-22 22:32:50
200bp的条带应该不是RNA，首先RNA容易降解，图谱中如果是RNA应该很弥散，而不是这么均一（虽然也模糊）；再者，已经用RNA酶处理过，楼上有人说RNA酶可能失活，其实RNA酶很难灭活，并且酶活力较高，所以很有可能不是 ...

但我的OD值确实太大了都超过2.1了 不知道是什么原因
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24楼2013-05-23 08:56:25
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field0073

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
24楼: Originally posted by 776142 at 2013-05-23 08:56:25
但我的OD值确实太大了都超过2.1了 不知道是什么原因...

OD值偏高和你样品中的离子含量过高有关。
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25楼2013-05-25 11:11:13
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昭思88

新虫 (初入文坛)
新手
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26楼2013-08-23 16:45:42
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776142

金虫 (正式写手)
引用回帖:
25楼: Originally posted by field0073 at 2013-05-25 11:11:13
OD值偏高和你样品中的离子含量过高有关。...

能详细解释下吗  谢谢
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27楼2013-08-27 09:12:03
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zploveme1314

新虫 (初入文坛)
不是很懂
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28楼2013-08-27 21:25:35
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weithermo

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
The bright band should be RNA. If you use the solution 1 from the kit to replace your solution 1, you may see the bright RNA band disappear. If this is the case, your solution 1 does not contain good RNase. But my question for you is why you want to use the manual alkaline lysis method not using the plasmid prep kit? It is only 1.2 RMB per prep in the market. Would it be better to spend your time somewhere else rather than do constant troubleshooting? Qiagen and Thermo Fisher Scientific and many others provide good quality kits. If you think they are expensive, you can try the ones made locally. It is important to save your time.
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29楼2013-08-28 01:21:05
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mint方

铜虫 (初入文坛)
新手学习了
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30楼2014-09-28 16:52:16
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天地一微尘

铁杆木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
OD值纯DNA在1.8左右，如果在1.9～2.0之间说明有RNA污染，你的大于2，而且加有RNase，排除操作失误，或比色杯污染，有可能就是DNA溶解，试着最后用水洗脱，而不用盐洗脱。
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31楼2014-09-28 22:59:25
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简单回复
ppandonghui2楼
2013-05-21 10:42   回复  
776142(金币+1): 谢谢参与
myprayer: 金币-1, 请勿单纯表情回复。。。下不为例，谢谢合作， 2013-05-21 13:20:44
冶金物理化学4楼
2013-05-21 10:56   回复  
776142(金币+1): 谢谢参与
myprayer: 金币-1, 请勿单纯表情回复。。。下不为例，谢谢合作， 2013-05-21 13:20:33
wullww5楼
2013-05-21 11:00   回复  
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weiyasong11楼
2013-05-21 15:28   回复  
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51102413514楼
2013-05-21 19:54   回复  
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樱木花道615楼
2013-05-21 19:56   回复  
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yingying158821楼
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