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mnbgtrew

铜虫 (初入文坛)

[求助] 关于SDS-PAGE失败原因分析

用的浓缩胶5%,电压80V;分离胶15%,电压120V.中间几个是跑的几个小于5K的小分子,没跑出来我认了,但是边上那个二十多的怎么会偏离这么多?还有,这种条带是叫弥散还是叫拖尾呢,有什么方法可以减缓,求指点。
关于SDS-PAGE失败原因分析
2013-05-19 20 时 23 分.gif
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kx444555

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
1。依照经验15%的分离胶是估计跑不出5K的,还需加大浓度,
2。最后泳道离MARKER比较远,胶有时在跑时会发热变形,差不多位置是对的,
3。个人觉得21K下的条带应该是降解的条带,建议在纯化过程或其它过程中加蛋白抑制剂试试看,
星陈代谢
2楼2013-05-19 22:45:23
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gwh775

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

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你的Marker怎么都跑的那么难看,是不是你的配胶的原料(母液,分离胶buffer,浓缩胶buffer,等)及跑胶缓冲液有问题?
虽然压力大,但路还是要走下去
3楼2013-05-19 22:55:43
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

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跑SDS-PAGE样品和marker不要离那么远,而且中间的泳道会比较好。最边上本身也容易跑歪。此外,你的5kD的蛋白最好用tricine胶跑,普通的SDS-PAGE在这么分子量小的区域会比较模糊,分辨率比较差。
4楼2013-05-20 01:46:09
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mnbgtrew

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by kx444555 at 2013-05-19 22:45:23
1。依照经验15%的分离胶是估计跑不出5K的,还需加大浓度,
2。最后泳道离MARKER比较远,胶有时在跑时会发热变形,差不多位置是对的,
3。个人觉得21K下的条带应该是降解的条带,建议在纯化过程或其它过程中加蛋白 ...

谢谢,那个21K的是纯的木瓜蛋白酶。你是说跑出那个位置是合理的,如果放的离Marker近一点就会正常是吗?还有,有哪些蛋白抑制剂可以加啊,我没加过,加进去不是也会对出现相对的蛋白条带对结果产生影响吗?
学习交流
5楼2013-05-20 11:30:21
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kx444555

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
mnbgtrew: 金币+10 2013-07-15 10:32:17
引用回帖:
5楼: Originally posted by mnbgtrew at 2013-05-20 11:30:21
谢谢,那个21K的是纯的木瓜蛋白酶。你是说跑出那个位置是合理的,如果放的离Marker近一点就会正常是吗?还有,有哪些蛋白抑制剂可以加啊,我没加过,加进去不是也会对出现相对的蛋白条带对结果产生影响吗?...

1.会正常的,
2.要看做什么后续实验了,如果只是为了验证条带对不对可以加,如果测酶活或者影响蛋白酶性质的就不要加,我以前用过PMSF,效果较好,
星陈代谢
6楼2013-05-20 12:20:17
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