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mnbgtrew

铜虫 (初入文坛)

[求助] 关于SDS-PAGE失败原因分析

用的浓缩胶5%，电压80V；分离胶15%，电压120V.中间几个是跑的几个小于5K的小分子，没跑出来我认了，但是边上那个二十多的怎么会偏离这么多？还有，这种条带是叫弥散还是叫拖尾呢，有什么方法可以减缓，求指点。
关于SDS-PAGE失败原因分析
2013-05-19 20 时 23 分.gif
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学习交流
1楼 2013-05-19 21:14:36
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kx444555

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1。依照经验15%的分离胶是估计跑不出5K的，还需加大浓度，
2。最后泳道离MARKER比较远，胶有时在跑时会发热变形，差不多位置是对的，
3。个人觉得21K下的条带应该是降解的条带，建议在纯化过程或其它过程中加蛋白抑制剂试试看，
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星陈代谢
2楼2013-05-19 22:45:23
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gwh775

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的Marker怎么都跑的那么难看，是不是你的配胶的原料（母液，分离胶buffer，浓缩胶buffer，等）及跑胶缓冲液有问题？
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虽然压力大，但路还是要走下去
3楼2013-05-19 22:55:43
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
跑SDS-PAGE样品和marker不要离那么远，而且中间的泳道会比较好。最边上本身也容易跑歪。此外，你的5kD的蛋白最好用tricine胶跑，普通的SDS-PAGE在这么分子量小的区域会比较模糊，分辨率比较差。
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4楼2013-05-20 01:46:09
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mnbgtrew

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kx444555 at 2013-05-19 22:45:23
1。依照经验15%的分离胶是估计跑不出5K的，还需加大浓度，
2。最后泳道离MARKER比较远，胶有时在跑时会发热变形，差不多位置是对的，
3。个人觉得21K下的条带应该是降解的条带，建议在纯化过程或其它过程中加蛋白 ...

谢谢，那个21K的是纯的木瓜蛋白酶。你是说跑出那个位置是合理的，如果放的离Marker近一点就会正常是吗？还有，有哪些蛋白抑制剂可以加啊，我没加过，加进去不是也会对出现相对的蛋白条带对结果产生影响吗？
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学习交流
5楼2013-05-20 11:30:21
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kx444555

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
mnbgtrew: 金币+10 2013-07-15 10:32:17
引用回帖:
5楼: Originally posted by mnbgtrew at 2013-05-20 11:30:21
谢谢，那个21K的是纯的木瓜蛋白酶。你是说跑出那个位置是合理的，如果放的离Marker近一点就会正常是吗？还有，有哪些蛋白抑制剂可以加啊，我没加过，加进去不是也会对出现相对的蛋白条带对结果产生影响吗？...

1.会正常的，
2.要看做什么后续实验了，如果只是为了验证条带对不对可以加，如果测酶活或者影响蛋白酶性质的就不要加，我以前用过PMSF，效果较好，
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星陈代谢
6楼2013-05-20 12:20:17
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