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崔永霞

铁虫 (小有名气)

[交流] 如和鉴定一个扩增出的序列是不是全长序列？

请问各位前辈，我用一个酶的全场cDNA序列设计的引物，产物预计大小是1200bp，我以DNA为模板扩增出的产物大于1200bp是什么原因啊？

    还有就是如何检测这个片段是不是全长？如果不是全长，是否可以以这个片段为模板做RACE扩增全长呢？
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1楼 2013-05-15 19:59:05
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bullfrog325

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
第一个问题, 可能这个基因没有内含子.
第二个问题, 你需要做5' 和 3' RACE.
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3楼2013-05-15 20:18:25
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崔永霞

铁虫 (小有名气)
补充一下，我是跨这个酶的cDNA序列的起始密码子和终止密码子设计的引物。
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2楼2013-05-15 20:00:42
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崔永霞

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-05-15 20:18:25
第一个问题, 可能这个基因没有内含子.
第二个问题, 你需要做5' 和 3' RACE.

如果没有内含子的话，那应该是扩出的片段大小不应该大于1200bp吧？
    还有就是关于RACE技术，不是应该是以RNA为模板扩增出cDNA第一链，然后以第一链为模板设计引物来做3‘RACE和5'RACE扩增全长吗？可是我是根据这个酶的全长cDNA来设计引物，然后扩增出的这个DNA片段，这样的话也可以用RACEA吗？
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4楼2013-05-16 10:44:59
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bullfrog325

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
崔永霞(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-05-16 16:59:31
汗一个, 对不住啊, 第一个问题看走眼了, 没有注意到"大于"....这样的话你要看看产物和基因组DNA的长度比较怎么样, 在这个基因有注释内含子的情况下, 如你的产物等于或者大于基因组DNA大小, 你就需要查污染(基因组DNA污染); 如果你的PCR产物大小是介于1200bp和基因组DNA大小的, 很有可能扩出来的是一个选择性剪切产物. 另外也检查一下引物的特异性, 防止别扩出来的是其他的东西.
至RACE, 你需要用做翻转录后的cDNA作为模板, 不能用已经扩出的那个大于1200bp的PCR, 因为两头的序列已经被设计的引物限制住了.
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5楼2013-05-16 16:06:13
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