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崔永霞

铁虫 (小有名气)


[交流] 如和鉴定一个扩增出的序列是不是全长序列?

请问各位前辈,我用一个酶的全场cDNA序列设计的引物,产物预计大小是1200bp,我以DNA为模板扩增出的产物大于1200bp是什么原因啊?

    还有就是如何检测这个片段是不是全长?如果不是全长,是否可以以这个片段为模板做RACE扩增全长呢?
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崔永霞

铁虫 (小有名气)


补充一下,我是跨这个酶的cDNA序列的起始密码子和终止密码子设计的引物。
2楼2013-05-15 20:00:42
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bullfrog325

木虫 (正式写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
第一个问题, 可能这个基因没有内含子.
第二个问题, 你需要做5' 和 3' RACE.
3楼2013-05-15 20:18:25
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崔永霞

铁虫 (小有名气)


引用回帖:
3楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-05-15 20:18:25
第一个问题, 可能这个基因没有内含子.
第二个问题, 你需要做5' 和 3' RACE.

如果没有内含子的话,那应该是扩出的片段大小不应该大于1200bp吧?
    还有就是关于RACE技术,不是应该是以RNA为模板扩增出cDNA第一链,然后以第一链为模板设计引物来做3‘RACE和5'RACE扩增全长吗?可是我是根据这个酶的全长cDNA来设计引物,然后扩增出的这个DNA片段,这样的话也可以用RACEA吗?
4楼2013-05-16 10:44:59
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bullfrog325

木虫 (正式写手)


★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
崔永霞(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流! 2013-05-16 16:59:31
汗一个, 对不住啊, 第一个问题看走眼了, 没有注意到"大于"....这样的话你要看看产物和基因组DNA的长度比较怎么样, 在这个基因有注释内含子的情况下, 如你的产物等于或者大于基因组DNA大小, 你就需要查污染(基因组DNA污染); 如果你的PCR产物大小是介于1200bp和基因组DNA大小的, 很有可能扩出来的是一个选择性剪切产物. 另外也检查一下引物的特异性, 防止别扩出来的是其他的东西.
至RACE, 你需要用做翻转录后的cDNA作为模板, 不能用已经扩出的那个大于1200bp的PCR, 因为两头的序列已经被设计的引物限制住了.
5楼2013-05-16 16:06:13
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