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20111987

金虫 (正式写手)

[求助] 已知秀丽隐杆线虫的引物序列，如何得到所扩增片段的长度

已知秀丽隐杆线虫的引物序列，如何得到所扩增片段的长度？
引物如下：
skn-1
5′-AGTGTCGGCGTTCCAGATTTC-3′；
5′-GTCGACGAATCTTGCGAATCA-3′；

sod-3
5'-CCAACCAGCGCTGAAATTCAATGG
5'-GGAACCGAAGTCGCGCTTAATAGT

daf-16(NM_001026247),
5′-TTTCCGTCCCCGAACTCAA-3′ ;
5′-ATTCGCCAACCCATGATGG-3′;       

hsp-16.2
5′-ACGCCAATTTGCTCCAGTCT-3′,
5′-GATGGCAAACTTTTGATCATTGTTA-3′;

ama-1       
5′-CTGACCCAAAGAACACGGTGA-3′
5′-TCCAATTCGATCCGAAGAAGC-3′

akt-2
5′-TTGTAAAACGACGGCCAG
5′-CATGATTACGCCAAGCTC

tub-1
5′-TCCAATTGCTCAACCACG-3′,
5′-AGGGAGTACTTCACTTGG-3′
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1楼 2012-05-28 08:15:06
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回帖置顶 ( 共有2个 )

duzhichao

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
20111987: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-05-28 15:31:02
amisking: 回帖置顶 2012-05-28 20:30:52
找到pubmed中Nucleotide界面，点击左侧工具条内的BLAST，进入blast界面，选择Nucleotide板块中的Search for short, nearly exact matches ，在Search 提供的空白区键入 上游（5‘-3’）nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn（20个以上的n）下游引物（5‘-3’），在其他选框中进行必要的限定。点击blast按钮。待进入下一界面后点击format, 待出现下一界面后，察看其中上下游引物能100%互补序列，用目的序列的最大碱基位置-最小碱基位置+1即目的片段的长度。需要补充说明的是，统一引物可能会blast到多条pcr产物，但目的片段的大小一致，主要是同一基因，有些提供的序列不完整造成的。 你试试。
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天道酬勤！
3楼2012-05-28 11:12:40
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hongqifei

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
20111987: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2012-05-28 15:31:23
amisking: 回帖置顶 2012-05-28 20:30:54
UCSC的In-Silico PCR。物种选C.elegans，后面输入引物序列即可。
链接在此：
http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/h ... amp;hgsid=273515433
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何须剑道争锋？千人指，万人封，可问江湖鼎峰，三尺秋水尘不染，天下无双。
4楼2012-05-28 12:47:34
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 20111987 at 2012-05-29 08:12:28
谢谢您的回复！我现在遇到的问题还有一个就是我用液体培养的线虫，离心获得虫体时会有线虫的食物也会随之残存，不知道应该如何处理，如果连食物一起研磨影响最后提取得到的RNA吗？...

这个好办，把虫体洗涤几次就可以了。收集了之后，3000g离心30秒~1分钟，虫体就可以离下来了，而细菌还在上清里。弃上清，加入水或者M9,混匀，再离心弃上清，反复2、3次，看到上清比较清就可以了。
如果提RNA是想克隆基因，那食物残余一点问题不大；如果是想做荧光定量PCR,那就像上面那样洗一下吧。因为荧光定量PCR用到的内参基因都是保守基因，可能细菌的也能被扩增出来；另外细菌的RNA也会让你对虫体RNA的量判断不准。
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20111987
10楼2012-05-29 11:16:58
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普通回帖

niushuaiji

金虫 (正式写手)

不放弃的小鸟

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
20111987: 金币+5, ★有帮助 2012-05-28 15:30:32
NCBi的oncogene输入查询基因的名称，找到一系列相关基因，再用去除酶切位点的引物序列按对分别比对！

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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Tobeornottobe,that'saproblem
2楼2012-05-28 09:10:26
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20111987

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by hongqifei at 2012-05-28 12:47:34
UCSC的In-Silico PCR。物种选C.elegans，后面输入引物序列即可。
链接在此：
http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr?wp_target=&db=0&org=C.+elegans&wp_f=&wp_r=&wp_size=4000&wp_perfe ...

非常感谢(⊙o⊙)哦！提供信息对我帮助很大，不知道楼主是否做过秀丽隐杆线虫的RNA提取，每次大概用多少虫体能提出来RNA呀，提的时候研磨了吗？用的是干虫体还是留少部分液体呢？
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5楼2012-05-28 15:37:08
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hongqifei

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 20111987 at 2012-05-28 15:37:08
非常感谢(⊙o⊙)哦！提供信息对我帮助很大，不知道楼主是否做过秀丽隐杆线虫的RNA提取，每次大概用多少虫体能提出来RNA呀，提的时候研磨了吗？用的是干虫体还是留少部分液体呢？...

我见过别人提过线虫RNA，大约30~100只，离心之后把液体吸走，加入Trizol，匀浆或研磨。
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何须剑道争锋？千人指，万人封，可问江湖鼎峰，三尺秋水尘不染，天下无双。
6楼2012-05-28 17:02:56
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20111987

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by hongqifei at 2012-05-28 17:02:56
我见过别人提过线虫RNA，大约30~100只，离心之后把液体吸走，加入Trizol，匀浆或研磨。...

哦，好的，谢谢！
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7楼2012-05-28 20:29:52
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 20111987 at 2012-05-28 15:37:08
非常感谢(⊙o⊙)哦！提供信息对我帮助很大，不知道楼主是否做过秀丽隐杆线虫的RNA提取，每次大概用多少虫体能提出来RNA呀，提的时候研磨了吗？用的是干虫体还是留少部分液体呢？...

我一般挑200颗卵，长到L4后一天提RNA。我用的是匀浆机，Trizol用500uL。最后得到的RNA在10~20微克左右。
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8楼2012-05-28 22:56:31
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20111987

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-05-28 22:56:31
我一般挑200颗卵，长到L4后一天提RNA。我用的是匀浆机，Trizol用500uL。最后得到的RNA在10~20微克左右。...

谢谢您的回复！我现在遇到的问题还有一个就是我用液体培养的线虫，离心获得虫体时会有线虫的食物也会随之残存，不知道应该如何处理，如果连食物一起研磨影响最后提取得到的RNA吗？
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9楼2012-05-29 08:12:28
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