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20111987

金虫 (正式写手)

[求助] 已知秀丽隐杆线虫的引物序列,如何得到所扩增片段的长度

已知秀丽隐杆线虫的引物序列,如何得到所扩增片段的长度?
引物如下:
skn-1
5′-AGTGTCGGCGTTCCAGATTTC-3′;
5′-GTCGACGAATCTTGCGAATCA-3′;

sod-3
5'-CCAACCAGCGCTGAAATTCAATGG
5'-GGAACCGAAGTCGCGCTTAATAGT

daf-16(NM_001026247),
5′-TTTCCGTCCCCGAACTCAA-3′ ;
5′-ATTCGCCAACCCATGATGG-3′;       

hsp-16.2
5′-ACGCCAATTTGCTCCAGTCT-3′,
5′-GATGGCAAACTTTTGATCATTGTTA-3′;

ama-1       
5′-CTGACCCAAAGAACACGGTGA-3′
5′-TCCAATTCGATCCGAAGAAGC-3′

akt-2
5′-TTGTAAAACGACGGCCAG
5′-CATGATTACGCCAAGCTC

tub-1
5′-TCCAATTGCTCAACCACG-3′,
5′-AGGGAGTACTTCACTTGG-3′
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

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5楼: Originally posted by 20111987 at 2012-05-28 15:37:08
非常感谢(⊙o⊙)哦!提供信息对我帮助很大,不知道楼主是否做过秀丽隐杆线虫的RNA提取,每次大概用多少虫体能提出来RNA呀,提的时候研磨了吗?用的是干虫体还是留少部分液体呢?...

我一般挑200颗卵,长到L4后一天提RNA。我用的是匀浆机,Trizol用500uL。最后得到的RNA在10~20微克左右。
8楼2012-05-28 22:56:31
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 20111987 at 2012-05-29 08:12:28
谢谢您的回复!我现在遇到的问题还有一个就是我用液体培养的线虫,离心获得虫体时会有线虫的食物也会随之残存,不知道应该如何处理,如果连食物一起研磨影响最后提取得到的RNA吗?...

这个好办,把虫体洗涤几次就可以了。收集了之后,3000g离心30秒~1分钟,虫体就可以离下来了,而细菌还在上清里。弃上清,加入水或者M9,混匀,再离心弃上清,反复2、3次,看到上清比较清就可以了。
如果提RNA是想克隆基因,那食物残余一点问题不大;如果是想做荧光定量PCR,那就像上面那样洗一下吧。因为荧光定量PCR用到的内参基因都是保守基因,可能细菌的也能被扩增出来;另外细菌的RNA也会让你对虫体RNA的量判断不准。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

10楼2012-05-29 11:16:58
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

引用回帖:
11楼: Originally posted by 20111987 at 2012-05-29 22:00:11
好的,知道了,非常感谢!我看文献中秀丽隐杆线虫内参有用act-1也有用ama-1的,这两个引物有什么区别吗?...

不同引物扩增不同基因,自然是不一样的啦
12楼2012-05-29 23:42:52
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