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20111987

金虫 (正式写手)

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[求助] 已知秀丽隐杆线虫的引物序列，如何得到所扩增片段的长度

已知秀丽隐杆线虫的引物序列，如何得到所扩增片段的长度？
引物如下：
skn-1
5′-AGTGTCGGCGTTCCAGATTTC-3′；
5′-GTCGACGAATCTTGCGAATCA-3′；

sod-3
5'-CCAACCAGCGCTGAAATTCAATGG
5'-GGAACCGAAGTCGCGCTTAATAGT

daf-16(NM_001026247),
5′-TTTCCGTCCCCGAACTCAA-3′ ;
5′-ATTCGCCAACCCATGATGG-3′;

hsp-16.2
5′-ACGCCAATTTGCTCCAGTCT-3′,
5′-GATGGCAAACTTTTGATCATTGTTA-3′;

ama-1
5′-CTGACCCAAAGAACACGGTGA-3′
5′-TCCAATTCGATCCGAAGAAGC-3′

akt-2
5′-TTGTAAAACGACGGCCAG
5′-CATGATTACGCCAAGCTC

tub-1
5′-TCCAATTGCTCAACCACG-3′,
5′-AGGGAGTACTTCACTTGG-3′

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1楼 2012-05-28 08:15:06

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西瓜

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引用回帖:

5楼: Originally posted by 20111987 at 2012-05-28 15:37:08
非常感谢(⊙o⊙)哦！提供信息对我帮助很大，不知道楼主是否做过秀丽隐杆线虫的RNA提取，每次大概用多少虫体能提出来RNA呀，提的时候研磨了吗？用的是干虫体还是留少部分液体呢？...

我一般挑200颗卵，长到L4后一天提RNA。我用的是匀浆机，Trizol用500uL。最后得到的RNA在10~20微克左右。

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8楼2012-05-28 22:56:31

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西瓜

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引用回帖:

9楼: Originally posted by 20111987 at 2012-05-29 08:12:28
谢谢您的回复！我现在遇到的问题还有一个就是我用液体培养的线虫，离心获得虫体时会有线虫的食物也会随之残存，不知道应该如何处理，如果连食物一起研磨影响最后提取得到的RNA吗？...

这个好办，把虫体洗涤几次就可以了。收集了之后，3000g离心30秒~1分钟，虫体就可以离下来了，而细菌还在上清里。弃上清，加入水或者M9,混匀，再离心弃上清，反复2、3次，看到上清比较清就可以了。
如果提RNA是想克隆基因，那食物残余一点问题不大；如果是想做荧光定量PCR,那就像上面那样洗一下吧。因为荧光定量PCR用到的内参基因都是保守基因，可能细菌的也能被扩增出来；另外细菌的RNA也会让你对虫体RNA的量判断不准。

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