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20111987

金虫 (正式写手)

[求助] 已知秀丽隐杆线虫的引物序列,如何得到所扩增片段的长度

已知秀丽隐杆线虫的引物序列,如何得到所扩增片段的长度?
引物如下:
skn-1
5′-AGTGTCGGCGTTCCAGATTTC-3′;
5′-GTCGACGAATCTTGCGAATCA-3′;

sod-3
5'-CCAACCAGCGCTGAAATTCAATGG
5'-GGAACCGAAGTCGCGCTTAATAGT

daf-16(NM_001026247),
5′-TTTCCGTCCCCGAACTCAA-3′ ;
5′-ATTCGCCAACCCATGATGG-3′;       

hsp-16.2
5′-ACGCCAATTTGCTCCAGTCT-3′,
5′-GATGGCAAACTTTTGATCATTGTTA-3′;

ama-1       
5′-CTGACCCAAAGAACACGGTGA-3′
5′-TCCAATTCGATCCGAAGAAGC-3′

akt-2
5′-TTGTAAAACGACGGCCAG
5′-CATGATTACGCCAAGCTC

tub-1
5′-TCCAATTGCTCAACCACG-3′,
5′-AGGGAGTACTTCACTTGG-3′
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 20111987 at 2012-05-29 08:12:28
谢谢您的回复!我现在遇到的问题还有一个就是我用液体培养的线虫,离心获得虫体时会有线虫的食物也会随之残存,不知道应该如何处理,如果连食物一起研磨影响最后提取得到的RNA吗?...

这个好办,把虫体洗涤几次就可以了。收集了之后,3000g离心30秒~1分钟,虫体就可以离下来了,而细菌还在上清里。弃上清,加入水或者M9,混匀,再离心弃上清,反复2、3次,看到上清比较清就可以了。
如果提RNA是想克隆基因,那食物残余一点问题不大;如果是想做荧光定量PCR,那就像上面那样洗一下吧。因为荧光定量PCR用到的内参基因都是保守基因,可能细菌的也能被扩增出来;另外细菌的RNA也会让你对虫体RNA的量判断不准。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

10楼2012-05-29 11:16:58
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查看全部 12 个回答

niushuaiji

金虫 (正式写手)

不放弃的小鸟

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
20111987: 金币+5, ★有帮助 2012-05-28 15:30:32
NCBi的oncogene输入查询基因的名称,找到一系列相关基因,再用去除酶切位点的引物序列按对分别比对!

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
Tobeornottobe,that'saproblem
2楼2012-05-28 09:10:26
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duzhichao

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
20111987: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-05-28 15:31:02
amisking: 回帖置顶 2012-05-28 20:30:52
找到pubmed中Nucleotide界面,点击左侧工具条内的BLAST,进入blast界面,选择Nucleotide板块中的Search for short, nearly exact matches ,在Search 提供的空白区键入 上游(5‘-3’)nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn(20个以上的n)下游引物(5‘-3’),在其他选框中进行必要的限定。点击blast按钮。待进入下一界面后点击format, 待出现下一界面后,察看其中上下游引物能100%互补序列,用目的序列的最大碱基位置-最小碱基位置+1即目的片段的长度。需要补充说明的是,统一引物可能会blast到多条pcr产物,但目的片段的大小一致,主要是同一基因,有些提供的序列不完整造成的。 你试试。
天道酬勤!
3楼2012-05-28 11:12:40
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hongqifei

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
20111987: 金币+10, ★★★★★最佳答案 2012-05-28 15:31:23
amisking: 回帖置顶 2012-05-28 20:30:54
UCSC的In-Silico PCR。物种选C.elegans,后面输入引物序列即可。
链接在此:
http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/h ... amp;hgsid=273515433
何须剑道争锋?千人指,万人封,可问江湖鼎峰,三尺秋水尘不染,天下无双。
4楼2012-05-28 12:47:34
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