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TIGER288

新虫 (初入文坛)

[求助] 新手求助：设计引物的困惑

想克隆一个植物的功能基因（推测其有），该基因目前仅在拟南芥中报道较多而在其他植物中报道还极少，因此NCBI找不到特别近缘的物种。但我想确定该基因在我所做的植物中的有无，可否直接根据拟南芥的核苷酸序列设计引物（拟南芥上公布的不同序列间相似度高），还是需要用氨基酸序列设计兼并引物？扩增片段多大才能判定其有（全长约2kb）？ 刚接触这方面，欢迎指导。
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1楼 2012-04-29 13:25:51
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cheng_xiao

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励发帖交流问题。 2012-04-29 17:17:55
可以，直接设计，一般是扩增出现目标片段大小的带后，测序来确定你扩增的对不对。
兼并引物吗就先别急了，兼并引物一般是1，2个碱基兼并，不能太多，太多会出现单个引物浓度不够，扩增效果不好
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我努力我奋斗我成功
2楼2012-04-29 15:42:45
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TIGER288

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cheng_xiao at 2012-04-29 15:42:45:
可以，直接设计，一般是扩增出现目标片段大小的带后，测序来确定你扩增的对不对。
兼并引物吗就先别急了，兼并引物一般是1，2个碱基兼并，不能太多，太多会出现单个引物浓度不够，扩增效果不好

如果直接设计引物RT-PCR扩增中间片段，是否需要考虑位置效应，多用几对引物呀？我用的是PP5.0。在什么情况下可以用cds的两端序列直接手工设计呀？见过文献中有人这么弄，不解。
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3楼2012-04-29 19:00:58
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cheng_xiao

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

就是你要扩增完全的开放阅读框，并且对比已知的序列两端比较保守，就可以。但你的只有拟南芥中出现已知序列，也可以这样做一下试一试，软件哪个都可以
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我努力我奋斗我成功
4楼2012-04-29 20:08:39
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