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rainlark

禁虫 (初入文坛)

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seesea68

金虫 (初入文坛)

★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
最好单酶切,效率高
生活是一场游戏
6楼2013-05-22 09:33:18
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,感谢你的慷慨解囊,期待你的精彩。 2013-05-14 11:01:56
推荐你用infusion的方法做,质粒载体太大,不好操作的,你自己去搜什么是infusion方法
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2013-05-14 02:03:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
小丹木木: 金币+3, 真心的经验,欢迎常来 2013-05-22 11:42:57
1. 载体片段和目的片段都去磷酸化后理论上不能相连。做双酶切连接一般不需要去磷酸化,因为连接的粘性末端不同。如果做去磷酸化,一般也是对载体片段做,不能两个都做。
2. 目的片段没有连上也是可能出现假阳性的,因为酶作用都是不完全的。而且,酶切条件不是最适合的时候,酶有可能有星活性。你说的克隆情况有些复杂,我觉得很可能是酶切没有切好。胶回收的载体片段可能含有单酶切产物。
我认为你做酶切时需要对质粒、PCR产物定量,根据DNA的量来确定酶的使用量,酶用量不要太大,有些酶对离子强度很敏感,酶切体系质粒的浓度不宜过高。
3楼2013-05-14 08:17:03
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rainlark

禁虫 (初入文坛)

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4楼2013-05-15 12:36:27
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