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fanchuannan铜虫 (小有名气)
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[求助]
最近做原核表达，有些问题求大神帮助啊
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本人本科新手一枚，最近用BL21表达一个GST标签的融合蛋白，正在做小量表达，质粒是学长构的。 说一下以前做的大体流程吧： 转化涂板42度过夜，挑菌，5ml LB 37度200r培养6h 提质粒检验发现有质粒 接菌1：1000于40ml LB，37度培养3小时后加IPTG至1mmolperL，28度过夜诱导 收菌3ml加20ul 2Xbuffer，煮十分钟，瞬离，全部上样。。。 结果发现一团糟啊一团糟，电泳条带发现诱导跟没诱导没什么变化，而且条带颜色都很深 自己总结一下可能出错的地方： 1.接菌比例太小，3小时培养后可能还没有到0.6或者连0.4都没到就加IPTG了，所以又到效果不好 2.IPTG浓度加的太多，是不是这次应该做一个梯度来看一看，0.1,0.3,0.6,0.8,1.0 3.上样之前是不是应该先用100ulPBS悬菌然后再加2Xbuffer煮沸 4.煮沸以后是不是应该离心时间长一点然后取上清点样啊？以前点的样在点样孔那里沉积了好多细胞碎片之类的东西 再求做原核表达的大神给点意见啊。。。现在小量的做不好后面的大量培养提蛋白也没法做。。。痛苦中啊 1跟4是加IPTG的，2跟5是未加IPTG的,4跟6是marker  2013-04-30 15.12.28.jpg |
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3楼2013-05-12 21:40:08
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【答案】应助回帖
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fanchuannan: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-05-13 23:51:13
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过程没什么太大问题，你自己总结的那几点都不会特别的影响实验结果。但是你这点用跑的太差了，跑成这样就算有区别也看不出来了。是不是胶配的不好？下次电压或者电流稍微小点，上样量也有点太多，建议重跑次电泳先看看，起码得条带明显了才能比较。 如果确实是没有结果的话，可以试试1:40接菌摇俩小时加IPTG，浓度暂时不用变，这是最适表达浓度，如果要可溶表达的话再去摸索浓度，现在得起码保证它表达才行。可以用37度诱导，还是那句话，先确定它表达了之后再摸索如何让它可溶表达。 |
2楼2013-05-12 19:33:17
peng5053
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5楼2013-05-12 23:02:25
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