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fanchuannan

铜虫 (小有名气)

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[求助] 最近做原核表达，有些问题求大神帮助啊

本人本科新手一枚，最近用BL21表达一个GST标签的融合蛋白，正在做小量表达，质粒是学长构的。
说一下以前做的大体流程吧：
转化涂板42度过夜，挑菌，5ml LB 37度200r培养6h
提质粒检验发现有质粒
接菌1：1000于40ml LB，37度培养3小时后加IPTG至1mmolperL，28度过夜诱导
收菌3ml加20ul 2Xbuffer，煮十分钟，瞬离，全部上样。。。
结果发现一团糟啊一团糟，电泳条带发现诱导跟没诱导没什么变化，而且条带颜色都很深
自己总结一下可能出错的地方：
1.接菌比例太小，3小时培养后可能还没有到0.6或者连0.4都没到就加IPTG了，所以又到效果不好
2.IPTG浓度加的太多，是不是这次应该做一个梯度来看一看，0.1,0.3,0.6,0.8,1.0
3.上样之前是不是应该先用100ulPBS悬菌然后再加2Xbuffer煮沸
4.煮沸以后是不是应该离心时间长一点然后取上清点样啊？以前点的样在点样孔那里沉积了好多细胞碎片之类的东西

再求做原核表达的大神给点意见啊。。。现在小量的做不好后面的大量培养提蛋白也没法做。。。痛苦中啊

1跟4是加IPTG的，2跟5是未加IPTG的,4跟6是marker

2013-04-30 15.12.28.jpg

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Tomakeeachdaycount。

1楼 2013-05-12 12:52:26

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cicelyzh

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

接菌的比例是有些小，不过在加IPTG诱导前你以测下OD确定菌的状态。而且，你的上样量太大。此外，你确定样品煮过离心后没有发粘？一般煮完的样品都是离心5-10分钟的。

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5楼2013-05-12 23:02:25

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feixiang1209

新虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
fanchuannan(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-12 22:46:48
fanchuannan: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-05-13 23:51:13

过程没什么太大问题，你自己总结的那几点都不会特别的影响实验结果。但是你这点用跑的太差了，跑成这样就算有区别也看不出来了。是不是胶配的不好？下次电压或者电流稍微小点，上样量也有点太多，建议重跑次电泳先看看，起码得条带明显了才能比较。
如果确实是没有结果的话，可以试试1:40接菌摇俩小时加IPTG，浓度暂时不用变，这是最适表达浓度，如果要可溶表达的话再去摸索浓度，现在得起码保证它表达才行。可以用37度诱导，还是那句话，先确定它表达了之后再摸索如何让它可溶表达。

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2楼2013-05-12 19:33:17

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