| 查看: 1414 | 回复: 6 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
fanchuannan铜虫 (小有名气)
|
[求助]
最近做原核表达，有些问题求大神帮助啊
|
|
|
本人本科新手一枚，最近用BL21表达一个GST标签的融合蛋白，正在做小量表达，质粒是学长构的。 说一下以前做的大体流程吧： 转化涂板42度过夜，挑菌，5ml LB 37度200r培养6h 提质粒检验发现有质粒 接菌1：1000于40ml LB，37度培养3小时后加IPTG至1mmolperL，28度过夜诱导 收菌3ml加20ul 2Xbuffer，煮十分钟，瞬离，全部上样。。。 结果发现一团糟啊一团糟，电泳条带发现诱导跟没诱导没什么变化，而且条带颜色都很深 自己总结一下可能出错的地方： 1.接菌比例太小，3小时培养后可能还没有到0.6或者连0.4都没到就加IPTG了，所以又到效果不好 2.IPTG浓度加的太多，是不是这次应该做一个梯度来看一看，0.1,0.3,0.6,0.8,1.0 3.上样之前是不是应该先用100ulPBS悬菌然后再加2Xbuffer煮沸 4.煮沸以后是不是应该离心时间长一点然后取上清点样啊？以前点的样在点样孔那里沉积了好多细胞碎片之类的东西 再求做原核表达的大神给点意见啊。。。现在小量的做不好后面的大量培养提蛋白也没法做。。。痛苦中啊 1跟4是加IPTG的，2跟5是未加IPTG的,4跟6是marker  2013-04-30 15.12.28.jpg |
回复此楼» 猜你喜欢
湖北师范大学招调剂啦
已经有9人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有135人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
化工申博
已经有3人回复
-
申博自荐
已经有2人回复
-
广西民族大学化学化工学院化学工程与技术学硕，材料化工专硕调剂名额充足！
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 原核表达和SDS-PAGE
已经有9人回复
- 原核表达引物设计的问题
已经有6人回复
- 做原核表达引物设计的有关问题
已经有14人回复
- 原核表达载体的构建
已经有37人回复
- 原核表达蛋白变小
已经有4人回复
- 蛋白激酶原核表达
已经有14人回复
- 原核表达，蛋白活性问题
已经有12人回复
- 真核表达载体 原核 区别与扩增
已经有8人回复
- 原核表达 pET32a和pET30a Western blot问题
已经有9人回复
- 原核表达形成了包涵体怎么办啊？
已经有22人回复
- 原核表达问题
已经有14人回复
- 原核表达蛋白诱导不出来
已经有16人回复
- 关于原核表达中，IPTG,KAN等的配制和最终工作浓度问题！！！
已经有16人回复
- 原核表达系统不表达目的蛋白
已经有8人回复
- 原核表达菌液裂解
已经有14人回复
- 原核表达标签的切除，及信号肽的影响
已经有5人回复
- 求助 原核表达WB 多条带
已经有11人回复
- 原核同时表达两个蛋白，需要自行给其中一个加标签，请教了！！！
已经有4人回复
- 【求助/交流】原核表达羊基因，cDNA长度约为3kb，基因为一种有活性的酶
已经有15人回复
cicelyzh
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 10
- 应助: 1662 (讲师)
- 金币: 8693.8
- 红花: 72
- 帖子: 3516
- 在线: 456小时
- 虫号: 1614001
- 注册: 2012-02-13
- 专业: 生物化学
5楼2013-05-12 23:02:25
feixiang1209
新虫 (初入文坛)
- 应助: 8 (幼儿园)
- 金币: 99.1
- 红花: 1
- 帖子: 31
- 在线: 7.6小时
- 虫号: 1801895
- 注册: 2012-05-07
- 专业: 膜生物化学与膜生物物理学
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
fanchuannan(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-12 22:46:48
fanchuannan: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-05-13 23:51:13
感谢参与，应助指数 +1
fanchuannan(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-12 22:46:48
fanchuannan: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-05-13 23:51:13
|
过程没什么太大问题，你自己总结的那几点都不会特别的影响实验结果。但是你这点用跑的太差了，跑成这样就算有区别也看不出来了。是不是胶配的不好？下次电压或者电流稍微小点，上样量也有点太多，建议重跑次电泳先看看，起码得条带明显了才能比较。 如果确实是没有结果的话，可以试试1:40接菌摇俩小时加IPTG，浓度暂时不用变，这是最适表达浓度，如果要可溶表达的话再去摸索浓度，现在得起码保证它表达才行。可以用37度诱导，还是那句话，先确定它表达了之后再摸索如何让它可溶表达。 |
2楼2013-05-12 19:33:17
kx444555
至尊木虫 (正式写手)
- 应助: 56 (初中生)
- 贵宾: 1.326
- 金币: 10554.2
- 散金: 288
- 红花: 12
- 帖子: 820
- 在线: 238小时
- 虫号: 999718
- 注册: 2010-04-18
- 性别: GG
- 专业: 植物遗传学
3楼2013-05-12 21:40:08
peng5053
银虫 (正式写手)
Dr.
- 应助: 3 (幼儿园)
- 金币: 303
- 散金: 216
- 帖子: 326
- 在线: 90.5小时
- 虫号: 589471
- 注册: 2008-08-29
- 性别: GG
- 专业: 蛋白质组学
4楼2013-05-12 21:50:30
