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fanchuannan

铜虫 (小有名气)

[求助] 最近做原核表达,有些问题求大神帮助啊

本人本科新手一枚,最近用BL21表达一个GST标签的融合蛋白,正在做小量表达,质粒是学长构的。
说一下以前做的大体流程吧:
转化涂板42度过夜,挑菌,5ml LB 37度200r培养6h
提质粒检验发现有质粒
接菌1:1000于40ml LB,37度培养3小时后加IPTG至1mmolperL,28度过夜诱导
收菌3ml加20ul 2Xbuffer,煮十分钟,瞬离,全部上样。。。
结果发现一团糟啊一团糟,电泳条带发现诱导跟没诱导没什么变化,而且条带颜色都很深
自己总结一下可能出错的地方:
1.接菌比例太小,3小时培养后可能还没有到0.6或者连0.4都没到就加IPTG了,所以又到效果不好
2.IPTG浓度加的太多,是不是这次应该做一个梯度来看一看,0.1,0.3,0.6,0.8,1.0
3.上样之前是不是应该先用100ulPBS悬菌然后再加2Xbuffer煮沸
4.煮沸以后是不是应该离心时间长一点然后取上清点样啊?以前点的样在点样孔那里沉积了好多细胞碎片之类的东西

再求做原核表达的大神给点意见啊。。。现在小量的做不好后面的大量培养提蛋白也没法做。。。痛苦中啊

1跟4是加IPTG的,2跟5是未加IPTG的,4跟6是marker

2013-04-30 15.12.28.jpg
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Tomakeeachdaycount。
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kx444555

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
fanchuannan(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-12 22:47:02
MAKER跑成这样,明显是胶做的不好,你自己总结的34条都有道理,就按照你说的然后再好好配胶,
祝好运
星陈代谢
3楼2013-05-12 21:40:08
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