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啊虫木

新虫 (初入文坛)

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[求助] 用简并引物跑PCR跑不出条带，愁死了

最近克隆一种药用真菌的漆酶基因，跑了四五次了，总是跑不出条带，除了maker啥也没有。PCR的退火温度每次都设置了10个梯度（最高55，最低45）。

简并引物（引物本身不知可不可行，求鉴定）：
引物1：5′-CA (C/T) TGGCA (C/T) GG (C/T) TTCTTCCA-3′
引物2：5′-TGGCA (A/G) TGGA (A/G) GAACCACGG-3′
加样体系（25μL）：
2.5μL 10×PCR Buffer（Mg2+）
2.0μL dNTP Mixture
1.0μL primerL1
1.0μL primerL2
2.0μL 模板 DNA
0.2μL ETaq
16.3 ddH2O
反应程序：
1. 94℃ 5min；
2. 94℃ 1min，50℃（有梯度，45-55） 45s，72℃ 2min，35 循环；
3. 72℃ 5min。

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1楼 2013-04-26 08:59:09

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sj082csh

银虫 (小有名气)

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专业: 水产基础生物学

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
啊虫木(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-04-29 14:02:34

用什么软件设计简并引物的？最近我用icodehop设计简并引物跑出了目的片段了。
25μl 反应体系：10×buffer 2.5 μl
                  dNTP       0.5 μl
                  引物1       1.0μl
                     引物2       1.0 μl
                  cDNA       1.0μl
                  Taq酶       0.5μl
                     ddH2O    ~~
反应参数：采用Touchdown