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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 用简并引物跑PCR跑不出条带，愁死了
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啊虫木

新虫 (初入文坛)

[求助] 用简并引物跑PCR跑不出条带，愁死了

最近克隆一种药用真菌的漆酶基因，跑了四五次了，总是跑不出条带，除了maker啥也没有。PCR的退火温度每次都设置了10个梯度（最高55，最低45）。

简并引物（引物本身不知可不可行，求鉴定）：
引物1：5′-CA (C/T) TGGCA (C/T) GG (C/T) TTCTTCCA-3′
引物2：5′-TGGCA (A/G) TGGA (A/G) GAACCACGG-3′
加样体系（25μL）：
2.5μL 10×PCR Buffer（Mg2+）
2.0μL dNTP Mixture
1.0μL primerL1
1.0μL primerL2
2.0μL 模板 DNA
0.2μL ETaq
16.3 ddH2O
反应程序：
1. 94℃ 5min；
2. 94℃ 1min，50℃（有梯度，45-55） 45s，72℃ 2min，35 循环；
3. 72℃ 5min。
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1楼 2013-04-26 08:59:09
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

Crescendo

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by sj082csh at 2013-04-26 23:49:51
用什么软件设计简并引物的？ 最近我用icodehop设计简并引物跑出了目的片段了。
25μl 反应体系：10×buffer   2.5 μl
                      dNTP         0.5 μl
                      引物1         1.0μl ...

朋友你好！看到你在的有关简并引物设计的帖子，想请教一下：我用codehop设计的几对引物为什么总是扩增不出来目的条带呢？我做的是普通pCR，用的酶是takara LA酶。你是怎么做的？具体怎么操作？谢谢！
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日拱一卒，功不唐捐
20楼2014-01-09 18:11:16
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普通回帖

bloodwar

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-26 10:43:21
不知道靶标序列光有引物有啥用啊。是不是抽提出问题了，片段多大A啊
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2楼2013-04-26 09:48:48
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啊虫木

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bloodwar at 2013-04-26 09:48:48
不知道靶标序列光有引物有啥用啊。是不是抽提出问题了，片段多大A啊

片段1600bp左右，抽提还可以。这个引物是根据真菌漆酶保守氨基酸序列设计的，有文献用过的。大神，指点下啊
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3楼2013-04-26 09:53:28
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德国工兵铲

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我也碰到过，用文献上所给的通用引物，怎么都扩不出来，后来我用了高保真酶，竟然扩出来了，楼主不妨试一试。
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4楼2013-04-26 10:06:20
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啊虫木

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 德国工兵铲 at 2013-04-26 10:06:20
我也碰到过，用文献上所给的通用引物，怎么都扩不出来，后来我用了高保真酶，竟然扩出来了，楼主不妨试一试。

你用的是什么高保真酶呢
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5楼2013-04-26 10:23:56
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stevenshi021

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励发贴交流，为楼主问题解决提供可能的线索！ 2013-04-26 14:40:42
可从镁离子和退货温度优化！此外，强烈建议使用NEB的phusion 或Q5 高保真酶，非常强大的酶。
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6楼2013-04-26 10:52:29
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德国工兵铲

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 啊虫木 at 2013-04-26 10:23:56
你用的是什么高保真酶呢...

是两年前了，记得当时是用TAKARA的公司的高保真酶，也是抱着试一试的态度，谁知道真P出来了。
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7楼2013-04-26 11:01:22
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p53jun

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
2个办法：
TOYOBO的KOD-plus或KOD-FX。
1000以内，成功率高很多，再over-lap PCR拼接.
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8楼2013-04-26 14:50:06
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sj082csh

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
啊虫木(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-04-29 14:02:34
用什么软件设计简并引物的？ 最近我用icodehop设计简并引物跑出了目的片段了。
25μl 反应体系：10×buffer   2.5 μl
                      dNTP         0.5 μl
                      引物1         1.0μl
                       引物2        1.0 μl
                      cDNA         1.0μl
                      Taq酶        0.5μl
                       ddH2O       ~~
反应参数：采用Touchdown
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9楼2013-04-26 23:49:51
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sanmiao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
啊虫木(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-04-29 14:03:31
高保真的酶，takara 的pyrobest，Thermo的Phusion，还有FastPfu都可以！效果都很好:

还有，2ul的模板，是不是有点多啊，有的时候模板浓度需要很少就可以了，多了里面有抑制成分，反而P不出来；一般5-10ng就可以了！
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10楼2013-04-27 09:44:39
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