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啊虫木

新虫 (初入文坛)

[求助] 用简并引物跑PCR跑不出条带,愁死了

最近克隆一种药用真菌的漆酶基因,跑了四五次了,总是跑不出条带,除了maker啥也没有。PCR的退火温度每次都设置了10个梯度(最高55,最低45)。

简并引物(引物本身不知可不可行,求鉴定):
引物1:5′-CA (C/T) TGGCA (C/T) GG (C/T) TTCTTCCA-3′
引物2:5′-TGGCA (A/G) TGGA (A/G) GAACCACGG-3′
加样体系(25μL):
2.5μL 10×PCR Buffer(Mg2+)
2.0μL dNTP Mixture
1.0μL primerL1
1.0μL primerL2
2.0μL 模板 DNA
0.2μL ETaq
16.3 ddH2O
反应程序:
1. 94℃ 5min;
2. 94℃ 1min,50℃(有梯度,45-55) 45s,72℃ 2min,35 循环;
3. 72℃ 5min。
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p53jun

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
2个办法:
TOYOBO的KOD-plus或KOD-FX。
1000以内,成功率高很多,再over-lap PCR拼接.
8楼2013-04-26 14:50:06
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bloodwar

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-26 10:43:21
不知道靶标序列光有引物有啥用啊。是不是抽提出问题了,片段多大A啊
2楼2013-04-26 09:48:48
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啊虫木

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by bloodwar at 2013-04-26 09:48:48
不知道靶标序列光有引物有啥用啊。是不是抽提出问题了,片段多大A啊

片段1600bp左右,抽提还可以。这个引物是根据真菌漆酶保守氨基酸序列设计的,有文献用过的。大神,指点下啊
3楼2013-04-26 09:53:28
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德国工兵铲

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我也碰到过,用文献上所给的通用引物,怎么都扩不出来,后来我用了高保真酶,竟然扩出来了,楼主不妨试一试。
4楼2013-04-26 10:06:20
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