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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 用简并引物跑PCR跑不出条带，愁死了
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啊虫木

新虫 (初入文坛)

[求助] 用简并引物跑PCR跑不出条带，愁死了

最近克隆一种药用真菌的漆酶基因，跑了四五次了，总是跑不出条带，除了maker啥也没有。PCR的退火温度每次都设置了10个梯度（最高55，最低45）。

简并引物（引物本身不知可不可行，求鉴定）：
引物1：5′-CA (C/T) TGGCA (C/T) GG (C/T) TTCTTCCA-3′
引物2：5′-TGGCA (A/G) TGGA (A/G) GAACCACGG-3′
加样体系（25μL）：
2.5μL 10×PCR Buffer（Mg2+）
2.0μL dNTP Mixture
1.0μL primerL1
1.0μL primerL2
2.0μL 模板 DNA
0.2μL ETaq
16.3 ddH2O
反应程序：
1. 94℃ 5min；
2. 94℃ 1min，50℃（有梯度，45-55） 45s，72℃ 2min，35 循环；
3. 72℃ 5min。
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1楼 2013-04-26 08:59:09
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Crescendo

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by sj082csh at 2013-04-26 23:49:51
用什么软件设计简并引物的？ 最近我用icodehop设计简并引物跑出了目的片段了。
25μl 反应体系：10×buffer   2.5 μl
                      dNTP         0.5 μl
                      引物1         1.0μl ...

朋友你好！看到你在的有关简并引物设计的帖子，想请教一下：我用codehop设计的几对引物为什么总是扩增不出来目的条带呢？我做的是普通pCR，用的酶是takara LA酶。你是怎么做的？具体怎么操作？谢谢！
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日拱一卒，功不唐捐
20楼2014-01-09 18:11:16
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