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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 定量PCR-引物二聚体问题
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mahoumeimei

金虫 (小有名气)

[求助] 定量PCR-引物二聚体问题

前段时间做了绝对定量，融解曲线显示有杂峰，怀疑是引物二聚体。但是产物电泳图上却没有看到明显的引物二聚体。样品平行性还不错，标准曲线的斜率是0.9947。我实验目的也不需要准确地知道每个样品目标基因的copy值，只需要看到目标基因的变化趋势就好了。请问这样的话，这些结果能用吗？因为实验已经基本结束了，不想再重新设计引物折腾了。
希望大家给点建议，非常感谢！

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1楼2013-04-07 21:11:14
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mahoumeimei

金虫 (小有名气)
错了，标准曲线的R2是0.9947
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2楼2013-04-07 21:12:45
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
mahoumeimei: 金币+5 2013-04-08 09:35:24
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-09 10:49:53
你的熔解曲线不是一般的有问题，从胶上看不到明显的引物二聚体不能说明其不存在。如果只是看趋势，可以直接做半定量PCR跑胶看结果。如果一定要做荧光定量，我认为你需要对体系进行优化。标准曲线的R2不错，只能说明标准曲线的线性还可以，扩增效率才是关键。你是否对PCR体系进行了优化？我觉得你可以做一下退火温度梯度，降低引物浓度。实在不行只能重新设计引物。
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3楼2013-04-08 00:44:41
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mahoumeimei

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-08 00:44:41
你的熔解曲线不是一般的有问题，从胶上看不到明显的引物二聚体不能说明其不存在。如果只是看趋势，可以直接做半定量PCR跑胶看结果。如果一定要做荧光定量，我认为你需要对体系进行优化。标准曲线的R2不错，只能说明 ...

尝试了好几个退火温度，引物浓度也做了两个。真的不可以用吗？导师等着要结果，不敢跟他说呢。
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4楼2013-04-08 09:38:05
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-09 10:50:07
引用回帖:
4楼: Originally posted by mahoumeimei at 2013-04-08 09:38:05
尝试了好几个退火温度，引物浓度也做了两个。真的不可以用吗？导师等着要结果，不敢跟他说呢。...

可能是引物有二级结构吧，重新设计引物看看吧。引物很便宜的，多设计几对。还有一个办法，虽然对做定量很不好，但是你只是想要看关系，你可以设计PCR程序时，在每个循环中加入82°C 10S （熔接引物二聚体），再时时读取荧光。
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5楼2013-04-09 00:54:49
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aga0110125

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果有引物二聚体也已经跑出去了
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6楼2013-04-09 10:45:49
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