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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切体系构建 新手！
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xjtu0025

新虫 (小有名气)

[求助] 双酶切体系构建 新手！

我是要做载体和目的产物链接
选的是ECOR1 和Xba I
TAKARA的
看了说明书，发现buffer不同啊。。。尽管是同一个温度下的，37.
这样我要怎么做呢？
EcoRI
体系
EcoR I 1 μl
10×H Buffer 2 μl
DNA ≤1 μg
灭菌水 up to 20 μl

10 × H
500mM Tris-HCl,
100mM MgCl2
10mM Dithiothreitol
1,000mM NaC

XbaI
体系
Xba I 1 μl
10×M Buffer 2 μl
0.1% BSA 2 μl
DNA ≤1 μg
灭菌水 up to 20 μl

10 × M
100mM Tris-HCl,pH7.5
100 mM MgCl2
10mM Dithiothreitol
500mM NaCl

XbaI的那个还要加BSA

我不能换了呀。。因为目的基因的酶切位点是pcr加上去的，前后多加了3个保护碱基。引物都设计好了，就等RNA一提出来，RTPCR一步式完以后直接切了再酶连的。。老师会杀了我的。。我只是本科毕业论文，没人教我。都是自己摸索的。。

难道要分步酶切再回收？重点是我现在那个产物的量还不好说，这样会不会很浪费产物？最后我要做克隆载体的。。
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1楼 2013-04-02 16:50:44
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+2, 赠人玫瑰手有余香。生物版块欢迎你的无私奉献。 2013-04-03 08:40:15
如果是新手，可以考虑用double digestion disigner,完全控制你的双酶切，推荐双酶切buffer，精确计算酶的用量，保证载体和外源片段酶切完全。http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/showresult.php
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4楼2013-04-02 22:52:06
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ytxy

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+2, 鼓励应助，分子生物版块，期待你的精彩。 2013-04-03 08:39:46
这是要毕业了吗，才开始做PCR？
可以分步酶切的：先用EcorI体系切（20ul)，切完扩大体系（比如30或40ul),按照XbaI体系切。你也可以买NEB的酶，好像两种酶是同一种buffer。
貌似你还没PCR？要是有非特异带你还得先割胶回收。
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2楼2013-04-02 17:37:02
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xjtu0025

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ytxy at 2013-04-02 17:37:02
这是要毕业了吗，才开始做PCR？
可以分步酶切的：先用EcorI体系切（20ul)，切完扩大体系（比如30或40ul),按照XbaI体系切。你也可以买NEB的酶，好像两种酶是同一种buffer。
貌似你还没PCR？要是有非特异带你还得先 ...

别提了，我养了一个月的细胞都没有用。因为去年冻存的细胞全部都是污染和死掉的，上个礼拜老师才找来新的细胞。这两天才开始提总RNA。
实验室很不健全，所有试剂材料都要自己配，重新买。还有很多都是过期的，老师也是不给用新的。

我找到TAKARA的里面双酶切的buffer了。
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3楼2013-04-02 19:00:26
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