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hc42

木虫 (小有名气)

[求助] 双向电泳的一些细节问题

各路大侠，走过路过不要错过。双向电泳博大精深，更多的是细节的把握，小弟初学双向电泳，再次抛砖引玉，望各路大侠解吾燃眉之急，也为后学者一个资料。

问题1：蛋白裂解液中的IPG buffer的pH与胶条的pH之间有没有严格的要求匹配？ps:我在两篇文献中看到胶条4-7的选择了3-10的buffer。

问题2：BIO-RAD的17cm的胶条的水化液上样量的范围是多少？ps:我之前上样量是360μl，但是很容易把水化液弄到电阻丝外或者胶的支撑面上。

问题3：第一向的电流在什么范围内算正常？ps:聚焦的时候，20μA/gel左右算正常吗？

问题4：大家觉得这张图能用来分析吗？

电泳图.png
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1楼 2013-04-01 19:21:47
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hc42

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-02 00:17:01
1. IPG buffer的pH需要包括胶条的pH范围，其作用是辅助蛋白寻找其在胶条中正确的等电点位置。所以跑4-7的胶条用3-10的IPG buffer完全没有问题。
2. 我做BIO-RAD的17cm的胶条的时候一般是上样量为300μl。样品+水化 ...

我们实验室用的考染方法是“Blue Silver”考马斯亮蓝染色法，在上一个实验中，我的材料和另一种材料同时染色，且上样量一样，但是我的材料的颜色明显比另一种材料的浅，我就在想，是不是不同的材料与染色液的亲和度不同，是不是应该增加染色时间来加深颜色？
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3楼2013-04-02 09:11:13
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
hc42: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-04-03 11:55:53
gyesang: 金币+2, 鼓励应助！ 2013-04-04 21:36:14
1. IPG buffer的pH需要包括胶条的pH范围，其作用是辅助蛋白寻找其在胶条中正确的等电点位置。所以跑4-7的胶条用3-10的IPG buffer完全没有问题。
2. 我做BIO-RAD的17cm的胶条的时候一般是上样量为300μl。样品+水化液做330μl，超速离心后取300μl上样。
3. 电流在聚焦过程中是变动的，20算是正常吧。
4. 胶能否用于分析主要看分辨率和重复性。不知道你想分析多少点呢？
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2楼2013-04-02 00:17:01
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
hc42: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-04-03 11:56:29
引用回帖:
3楼: Originally posted by hc42 at 2013-04-02 09:11:13
我们实验室用的考染方法是“Blue Silver”考马斯亮蓝染色法，在上一个实验中，我的材料和另一种材料同时染色，且上样量一样，但是我的材料的颜色明显比另一种材料的浅，我就在想，是不是不同的材料与染色液的亲和度 ...

一般是亲水性强的蛋白考染效果好，因为亲水蛋白有较多的赖氨酸和精氨酸残基。而对于疏水性强的蛋白，考染效果不是很理想。尤其是分子量小的膜蛋白，由于本身这些与染料结合的氨基酸残基少，染色浅也是没有办法的事情。不过，对于在不同样品里面的同一蛋白，与染料的结合能力是相同的，所以可以定量比较。
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4楼2013-04-02 15:11:09
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hc42

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-02 15:11:09
一般是亲水性强的蛋白考染效果好，因为亲水蛋白有较多的赖氨酸和精氨酸残基。而对于疏水性强的蛋白，考染效果不是很理想。尤其是分子量小的膜蛋白，由于本身这些与染料结合的氨基酸残基少，染色浅也是没有办法的事 ...

多谢大侠的指点，那我也不用纠结点的深浅了。今天刚在试R-250的染色方法，听说灵敏度更高点，希望结果能让人满意。
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5楼2013-04-03 12:04:25
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