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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助! GST-tag 重组蛋白纯化
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sc5921041

木虫 (著名写手)

[求助] 求助! GST-tag 重组蛋白纯化

将目的蛋白片段连接到GST载体上，已酶切验证连接成功。 但是IPTG 诱导， GST beads 结合后洗脱竟然完全没有蛋白，连GST蛋白和杂带都没有！ 重复了三次都这样，求分析原因！！ 已排除IPTG， GST beads 和GST 洗脱液的问题。BL21 和DH5α 都试过了...  
难道是蛋白就不表达？？？是菌的问题？？？以前做过同样的操作，没有遇见这样的问题，至少也有GST的带。
做的我连实验最基本的操作都没信心了！！！ 求指导
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nostalgia
1楼 2013-03-13 12:54:49
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gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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sc5921041: 金币+3, ★有帮助 2013-03-13 21:19:22
确定读码框没错吗？连得GST载体是什么？pGEX系列的？可以试一下你没有连接你自己的蛋白的这个载体，看看有没有GST的表达呢？
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2楼2013-03-13 12:57:58
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linxt2005

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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sc5921041: 金币+3, ★有帮助 2013-03-13 21:19:29
表达测试后先进行SDS-PAGE甚至WB/elisa检测，确认目的蛋白有表达，然后再进行层析测试。
从你表述上来看，如果构建没有问题的话，可能是没有表达；
另外，层析后检测是可有添加上样前、穿透的泳道，有可能目的蛋白表达了但没有与填料结合。
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小兵一个
3楼2013-03-13 13:02:51
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sc5921041

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gaojuan1985 at 2013-03-12 23:57:58
确定读码框没错吗？连得GST载体是什么？pGEX系列的？可以试一下你没有连接你自己的蛋白的这个载体，看看有没有GST的表达呢？

pGEX-KG
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nostalgia
4楼2013-03-13 21:20:41
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xyoung88

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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sc5921041: 金币+3, ★有帮助 2013-03-14 07:21:18
1）先看构建对不对； 2）母液走SDS-PAGE胶看是否有表达；3）再看是不是GST不binding.
我个人觉得如果构建对的话就是没有表达。
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5楼2013-03-14 02:26:47
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