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sc5921041

木虫 (著名写手)

[求助] 求助! GST-tag 重组蛋白纯化

将目的蛋白片段连接到GST载体上,已酶切验证连接成功。 但是IPTG 诱导, GST beads 结合后洗脱竟然完全没有蛋白,连GST蛋白和杂带都没有! 重复了三次都这样,求分析原因!! 已排除IPTG, GST beads 和GST 洗脱液的问题。BL21 和DH5α 都试过了...  
难道是蛋白就不表达???是菌的问题???以前做过同样的操作,没有遇见这样的问题,至少也有GST的带。
做的我连实验最基本的操作都没信心了!!! 求指导
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nostalgia
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gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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sc5921041: 金币+3, 有帮助 2013-03-13 21:19:22
确定读码框没错吗?连得GST载体是什么?pGEX系列的?可以试一下你没有连接你自己的蛋白的这个载体,看看有没有GST的表达呢?
2楼2013-03-13 12:57:58
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linxt2005

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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sc5921041: 金币+3, 有帮助 2013-03-13 21:19:29
表达测试后先进行SDS-PAGE甚至WB/elisa检测,确认目的蛋白有表达,然后再进行层析测试。
从你表述上来看,如果构建没有问题的话,可能是没有表达;
另外,层析后检测是可有添加上样前、穿透的泳道,有可能目的蛋白表达了但没有与填料结合。
小兵一个
3楼2013-03-13 13:02:51
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sc5921041

木虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gaojuan1985 at 2013-03-12 23:57:58
确定读码框没错吗?连得GST载体是什么?pGEX系列的?可以试一下你没有连接你自己的蛋白的这个载体,看看有没有GST的表达呢?

pGEX-KG
nostalgia
4楼2013-03-13 21:20:41
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xyoung88

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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sc5921041: 金币+3, 有帮助 2013-03-14 07:21:18
1)先看构建对不对; 2)母液走SDS-PAGE胶看是否有表达;3)再看是不是GST不binding.
我个人觉得如果构建对的话就是没有表达。
5楼2013-03-14 02:26:47
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