| 查看: 2737 | 回复: 9 | |||
[交流]
酶切后的补平连接 已有4人参与
|
|
我正在构一个长片段的载体，3500的基因往6100的载体上连。 但载体上对应基因的酶切位点很少，用MBI的快速酶切载体和基因，基因的上游只能用平末端酶，构载体时上游没有合适的酶切位点，只能用一个普通的酶切割后，再用补平酶将其末端补平，然后再进行第二次酶切，下游的酶切位点是粘性末端，双酶切产物纯化后连接。 我现在遇到的问题是载体经过第一次单切，末端补平，第二次单切纯化后与基因相连（基因是这两个酶同时切，上游平下游粘），但就是连不上。MBI的说明书上说快速酶，补平酶的buffer可以通用，效率都可达到100%，因此在第一次单切后补平时就没有纯化，直接在里面加上补平酶，反应结束后，再加一些第二次单切的酶，最后再纯化。 我想问一下，在这个一次单切，补平，二次单切的过程中是不是有什么需要注意的事项，我现在怀疑我的载体要么有一个酶没有切开，要么就是补平不完全，导致与基因的双酶切产物连不上。 |
回复此楼» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有260人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 关于平末端连接
已经有14人回复
- 关于酶切后的连接问题，共同探讨共同进步
已经有18人回复
- 酶切后未纯化连接出现的问题
已经有18人回复
- pAN7-1质粒分析
已经有18人回复
- 基因克隆中酶切连接问题
已经有13人回复
- 单酶切连接的问题
已经有4人回复
- 连接酶切问题
已经有10人回复
- DNA的连接反应
已经有5人回复
- 【求助/交流】酶切后的粘性末端补平
已经有4人回复
- 已知全长基因怎样克隆并构建表达载体
已经有8人回复
- 【求助/交流】T-DNA全长约10000bp能否转入植物基因组。
已经有22人回复
- 【求助/交流】关于酶切产物连接的一点问题
已经有13人回复
- 【求助/交流】酶切位点重合了的两个酶的酶切问题
已经有13人回复
- 请教：Xho1的酶切连接
已经有5人回复
- 【求助/交流】单酶切连接的克隆急……
已经有10人回复
- 【求助/交流】质粒pPICZA酶切问题
已经有5人回复
2楼2013-03-13 01:42:20
cicelyzh
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 10
- 应助: 1662 (讲师)
- 金币: 8693.8
- 红花: 72
- 帖子: 3516
- 在线: 456小时
- 虫号: 1614001
- 注册: 2012-02-13
- 专业: 生物化学
3楼2013-03-13 04:06:32
liyu0355
木虫 (正式写手)
- 应助: 33 (小学生)
- 金币: 3566.3
- 红花: 5
- 帖子: 402
- 在线: 336.2小时
- 虫号: 13467
- 注册: 2003-05-31
- 性别: GG
- 专业: 基因表达调控与表观遗传学
4楼2013-03-13 08:32:04
5楼2013-03-13 10:20:20
6楼2013-03-13 10:21:15
cicelyzh
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 10
- 应助: 1662 (讲师)
- 金币: 8693.8
- 红花: 72
- 帖子: 3516
- 在线: 456小时
- 虫号: 1614001
- 注册: 2012-02-13
- 专业: 生物化学
7楼2013-03-13 10:27:18
8楼2013-03-13 10:59:31
9楼2013-03-13 11:21:16
10楼2013-10-08 16:00:47
