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酶切后的补平连接 已有4人参与
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我正在构一个长片段的载体，3500的基因往6100的载体上连。 但载体上对应基因的酶切位点很少，用MBI的快速酶切载体和基因，基因的上游只能用平末端酶，构载体时上游没有合适的酶切位点，只能用一个普通的酶切割后，再用补平酶将其末端补平，然后再进行第二次酶切，下游的酶切位点是粘性末端，双酶切产物纯化后连接。 我现在遇到的问题是载体经过第一次单切，末端补平，第二次单切纯化后与基因相连（基因是这两个酶同时切，上游平下游粘），但就是连不上。MBI的说明书上说快速酶，补平酶的buffer可以通用，效率都可达到100%，因此在第一次单切后补平时就没有纯化，直接在里面加上补平酶，反应结束后，再加一些第二次单切的酶，最后再纯化。 我想问一下，在这个一次单切，补平，二次单切的过程中是不是有什么需要注意的事项，我现在怀疑我的载体要么有一个酶没有切开，要么就是补平不完全，导致与基因的双酶切产物连不上。 |
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