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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切后的补平连接
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小猫三两只

金虫 (正式写手)

[交流] 酶切后的补平连接 已有4人参与

我正在构一个长片段的载体，3500的基因往6100的载体上连。
但载体上对应基因的酶切位点很少，用MBI的快速酶切载体和基因，基因的上游只能用平末端酶，构载体时上游没有合适的酶切位点，只能用一个普通的酶切割后，再用补平酶将其末端补平，然后再进行第二次酶切，下游的酶切位点是粘性末端，双酶切产物纯化后连接。
我现在遇到的问题是载体经过第一次单切，末端补平，第二次单切纯化后与基因相连（基因是这两个酶同时切，上游平下游粘），但就是连不上。MBI的说明书上说快速酶，补平酶的buffer可以通用，效率都可达到100%，因此在第一次单切后补平时就没有纯化，直接在里面加上补平酶，反应结束后，再加一些第二次单切的酶，最后再纯化。
我想问一下，在这个一次单切，补平，二次单切的过程中是不是有什么需要注意的事项，我现在怀疑我的载体要么有一个酶没有切开，要么就是补平不完全，导致与基因的双酶切产物连不上。
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1楼 2013-03-13 01:21:21
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
没事做啥平末端连接，还是这么大的片段，本来成功率就低。
现在构建方法这么多
CPEC golden gate   gibson assembly选一个合适的好了
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2楼2013-03-13 01:42:20
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
感觉你的做法很累，直接用单酶切连到载体里后再筛一下正反，或者两边都用平端连。
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3楼2013-03-13 04:06:32
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liyu0355

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
NovoRec®PCR一步定向克隆试剂盒

我用这个构建表达载体,特别好用,不管粘性末端还是平头末端.很方便的连接,你可以试试.
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4楼2013-03-13 08:32:04
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-03-13 01:42:20
没事做啥平末端连接，还是这么大的片段，本来成功率就低。
现在构建方法这么多
CPEC golden gate   gibson assembly选一个合适的好了

CPEC方法也试过，做了很多次，都没连上，平末端我也不想啊，但没有合适的酶切位点，只能至少一个用平末端
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5楼2013-03-13 10:20:20
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-13 04:06:32
感觉你的做法很累，直接用单酶切连到载体里后再筛一下正反，或者两边都用平端连。

这样会好连？平末端不是比粘性末端更难连，而且载体还容易自连。
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6楼2013-03-13 10:21:15
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★
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引用回帖:
6楼: Originally posted by 小猫三两只 at 2013-03-13 10:21:15
这样会好连？平末端不是比粘性末端更难连，而且载体还容易自连。...

连平末端载体要做去磷酸化，对PCR的产物进行磷酸化，然后16°C连过夜就可以了。
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7楼2013-03-13 10:27:18
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by liyu0355 at 2013-03-13 08:32:04
NovoRec®PCR一步定向克隆试剂盒

我用这个构建表达载体,特别好用,不管粘性末端还是平头末端.很方便的连接,你可以试试.

这个应该就是不需酶切连接的构载体的方法吧，我以前试过别的公司的，你这个大概需要多少钱，多少次的？
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8楼2013-03-13 10:59:31
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
★
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平末端连接有个用ccdB selection的，可以去掉载体的背景，我没用过（从没遇到需要这么连的。）
似乎是TOPO cloning啥的（似乎大小片段也不一样），有些人说好用
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9楼2013-03-13 11:21:16
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574759350

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
您好，看到你的帖子，我现在做的正好和你做的是相似的，请教一下你的问题现在解决了没有，有没有筛选到阳性克隆？
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10楼2013-10-08 16:00:47
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