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huajin2628

金虫 (正式写手)

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[求助] 感受态的制备

求感受态制备注意事项和经验！

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寓念于风

1楼 2013-03-09 22:38:50

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goudan880220

铜虫 (初入文坛)

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★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-07-18 14:44:20

氯化钙法（Calcium Chloride）本方法适用于批量制备大肠杆菌感受态细胞，所得感受态细胞可以获得5 x 106 到 2x 107 转化克隆/微克超螺旋质粒DNA材料（MATERIALS）缓冲液和溶液（Buffers and Solutions）（冰冷的）CaCl2•2H2O (1 M)冰冷的MgCl2-CaCl2 s溶液(solution, ice cold)培养基（Media）用于初始培养物培养的LB肉汤（L-broth for initial growth of culture）LB agar plates containing appropriate antibiotic核酸（Nucleic Acids）质粒DNA （Plasmid DNA）或经过重组的质粒（recombinant plasmid）方法1.从37°C过夜(16-20 hours)培养平皿内挑取一个直径约为2到3毫米的单菌落。把这样的单菌落接种于一只装有5毫升LB肉汤的30毫升灭菌试管中，于37°C下振荡培养过夜。2. 转移0.2毫升过夜培养物于一只装有15或20毫升LB的50毫升灭菌三角瓶中. 于37°C下振荡培养2到2.5小时（此时细菌处于对数生长期）。3. 室温下，4000 rpm离心5分钟收集对数期细胞。弃培养基，保留细胞沉淀。5. 加入10毫升冰冷的MgCl2-CaCl2 溶液，并轻微打匀。6. 4°C下，4000 rpm离心10分钟收集细胞。7. 弃MgCl2-CaCl2 溶液，保留细胞沉淀。8. 加入0.8毫升(每25毫升初始培养物加入1毫升)冰冷的0.1M的CaCl2 溶液，并轻微打匀。冰浴放置若干小时为最好。9. 此时的感受态细胞可以依照下面的步骤10到16直接进行转化操作，也可以分装,加入甘油后于-70°C冰冻保藏。10. 向事先灭菌，并经冷处理的1.5ml 聚丙烯管中转移100微升感受态细胞悬浮液。向每个转化管中加入DNA(一般含量是10微升或更低的体积中所含量应不超过50纳克)。细心混匀管中成份。于冰浴放置30到40分钟。11. 把转化管转移至放于42°C循环水浴锅中预热的试管架上，准确计时90秒。（此时不能摇动转化管）12. 把试管迅速转移至冰浴2到3分钟。13. 向每只试管中加入500微升LB肉汤。37°C放置45到90分钟，以使细菌复原，并容许质粒所编码的抗生素抗性的表达。14. 转移适量体积（如果使用90毫米平板，一半涂布量不应超过100微升）的经转化处理的感受态细胞涂布于含有相应抗生素的LB-琼脂平板上。15. 室温放置平板直到其上液体被吸收。16. 于37°C倒置平板培养。转化克隆应该于12-16 小时区间出现。