应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » DH5a感受态细胞制备问题
171/2返回列表12下一页
查看: 3816  |  回复: 16
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

含羞草liu

新虫 (小有名气)

[求助] DH5a感受态细胞制备问题

大家好！我是第一次制备DH5a感受态，为了克隆测序使用。因为我们实验室之前没有人做过，所以在制备过程中出现了问题，想向大家请教。

我是从生工买回的大肠杆菌DH5a菌株，放于－20度保存。我先配制了LB固体和液体培养基，高压灭菌20min。灭菌结束立即将LB固体培养基倒入平板内，待其凝固后，用灭菌牙签将DH5a菌株接种到平板上（分区划线），然后置于37度烘箱过夜培养，约24小时，取出，发现已长出菌落。然后在用灭菌牙签挑取DH5a单菌落于5ml液体培养基（50ml的三角瓶装）中，然后置于摇床上培养过夜，37度，200rpm，约12小时后，取出，发现菌液出现明显的浑浊。然后，我用移液枪吸取菌液1ml放入100ml的液体LB培养基（250ml三角瓶装），然后放入摇床（37度，200rpm），3小时左右，取出一瓶测其OD600值，发现只有0.05左右，延长摇床培养时间，甚至到24小时~48小时，取出测OD600，OD600值也只是达到1点几，怎么也不会达到0.5。关于接种的整个过程都是在超净工作台上进行的，不知道出现这样的结果是什么问题。我已经作了很多次尝试，每次都是OD600达不到要求。

遇到这个问题，我真的很着急，因为等着克隆测序，所以想请大家帮忙指点迷津！感激不尽！！！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
努力，奋斗，拼搏。。。
1楼 2012-07-21 20:54:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chlorella409

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
从你的实验过程来看，你第一次的活化时间太长了，24小时有可能长出杂菌了，大肠杆菌培养时间一般是不超过16小时的。
赞一下 回复此楼
2楼2012-07-21 21:22:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

含羞草liu

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by chlorella409 at 2012-07-21 21:22:29
从你的实验过程来看，你第一次的活化时间太长了，24小时有可能长出杂菌了，大肠杆菌培养时间一般是不超过16小时的。

有的，从16小时到24小时都试过的……
赞一下 回复此楼
努力，奋斗，拼搏。。。
3楼2012-07-21 22:40:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

beautybanana

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
制作感受态细胞可以不用测OD值的，只要菌液比较浑浊就可以，即使不是十分浑浊，你多取些菌液离心增加菌的浓度仍然是可以的，这个很容易做的。一般用冷的CaCl法做感受态细胞是没有问题的，做好后分装到小管里，每管200uL左右用液氮立即冷冻，在放到-80℃冰箱保存即可。
赞一下 回复此楼
4楼2012-07-22 09:57:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liuyu_sdili

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-24 13:36:46
"我用移液枪吸取菌液1ml放入100ml的液体LB培养基（250ml三角瓶装）", 250mL的瓶子最多装50mL就够了，多了通气不好菌就长不起来~~~你装了100mL，所以才长得特别慢~~
赞一下 回复此楼
5楼2012-07-22 15:56:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

含羞草liu

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by liuyu_sdili at 2012-07-22 15:56:55
"我用移液枪吸取菌液1ml放入100ml的液体LB培养基（250ml三角瓶装）", 250mL的瓶子最多装50mL就够了，多了通气不好菌就长不起来~~~你装了100mL，所以才长得特别慢~~

补充一下，划线平板上的单菌落很多，没有全部移入液体培养基中，剩下的菌能保存下次使用吗？如果可以的话，怎么保存呢？是直接放在超净工作台中，还是放在4度冰箱？还有，配制好、灭过菌的固体或液体培养基没有使用完，也可以保存吗？4度冰箱保存行吗？
赞一下 回复此楼
努力，奋斗，拼搏。。。
6楼2012-07-22 17:52:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

豆豆思密达

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以的，菌一般4度可以，培养基室温就行了。。。
赞一下 回复此楼
7楼2012-07-23 16:29:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liuyu_sdili

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 含羞草liu at 2012-07-22 17:52:41
补充一下，划线平板上的单菌落很多，没有全部移入液体培养基中，剩下的菌能保存下次使用吗？如果可以的话，怎么保存呢？是直接放在超净工作台中，还是放在4度冰箱？还有，配制好、灭过菌的固体或液体培养基没有使用 ...

最好还是现从冰箱冻存的甘油管中划线做感受态而不用4℃保存的，对于培养基，灭过菌没有打开的当然常温就可以，如果在超净台上打开的可以先室温放几天，没有长菌的也可以继续使用~~~
赞一下 回复此楼
8楼2012-07-23 17:58:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我可以猜测你的分光光度计坏了吗，我觉得有这个可能性，如果肉眼能看出来很浑浊，而分光光度计测不出来的话，就有这可能
赞一下 回复此楼
9楼2012-07-23 18:48:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nhtarnold

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我们做感受态都不用分光光度计，看着浑浊了离完心就会有很多，没必要非测OD600吧？
赞一下 回复此楼
10楼2012-07-24 10:09:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 含羞草liu 的主题更新
171/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +4 且听虎啸 2026-08-17 5/250 2026-08-18 00:49 by 蔡棒棒菂
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +6 angus9576 2026-08-17 11/550 2026-08-17 23:57 by angus9576
[基金申请] filecode=后面第一个是大写字母 +8 wangze12014 2026-08-14 10/500 2026-08-17 17:05 by xter9665
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +4 基诺咪客 2026-08-17 4/200 2026-08-17 16:10 by Vivilian
[基金申请] 哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？ +12 Ldrop2023 2026-08-13 15/750 2026-08-17 15:02 by 小豌豆_发芽
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +8 zju2000 2026-08-16 9/450 2026-08-17 12:20 by lmz0216
[基金申请] 2027广东省杰青 +3 奶牛小黑 2026-08-15 6/300 2026-08-16 20:07 by 奶牛小黑
[基金申请] 快农历七夕节了，轻松一下，男人悄悄话，女施主请不要进来。 +3 Tide man 2026-08-14 3/150 2026-08-16 17:47 by jurkat.1640
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +7 启萌科技 2026-08-12 26/1300 2026-08-16 12:35 by 启萌科技
[基金申请] 有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验） +10 majunge000 2026-08-11 12/600 2026-08-16 08:18 by xli1984
[精细化工] 招聘 金属平磨液，抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果？ +4 yuleib84 2026-08-11 4/200 2026-08-14 23:05 by lfy8008
[硕博家园] 读博的好处 +4 lnee 2026-08-11 4/200 2026-08-14 10:20 by ahsoarli
[基金申请] 重要来源：本周末出结果 +10 瞬息宇宙 2026-08-12 10/500 2026-08-13 15:46 by likettle
[基金申请] 不应该看fileCode +7 且听虎啸 2026-08-12 9/450 2026-08-13 14:27 by flydreamws
[基金申请] Filecode 又变了，巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
[基金申请] 分享一下我之前已中青C的计划书的filecode +4 布布和一二 2026-08-11 5/250 2026-08-13 12:56 by cratir
[基金申请] 2019年青年基金涵评意见，大家看看几个A，几个B? +11 Tide man 2026-08-11 11/550 2026-08-13 07:35 by 撸猫猫
[基金申请] 什么时候出结果，有咨询渠道？？？ +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭