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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » DH5a感受态细胞制备问题
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含羞草liu

新虫 (小有名气)

[求助] DH5a感受态细胞制备问题

大家好！我是第一次制备DH5a感受态，为了克隆测序使用。因为我们实验室之前没有人做过，所以在制备过程中出现了问题，想向大家请教。

我是从生工买回的大肠杆菌DH5a菌株，放于－20度保存。我先配制了LB固体和液体培养基，高压灭菌20min。灭菌结束立即将LB固体培养基倒入平板内，待其凝固后，用灭菌牙签将DH5a菌株接种到平板上（分区划线），然后置于37度烘箱过夜培养，约24小时，取出，发现已长出菌落。然后在用灭菌牙签挑取DH5a单菌落于5ml液体培养基（50ml的三角瓶装）中，然后置于摇床上培养过夜，37度，200rpm，约12小时后，取出，发现菌液出现明显的浑浊。然后，我用移液枪吸取菌液1ml放入100ml的液体LB培养基（250ml三角瓶装），然后放入摇床（37度，200rpm），3小时左右，取出一瓶测其OD600值，发现只有0.05左右，延长摇床培养时间，甚至到24小时~48小时，取出测OD600，OD600值也只是达到1点几，怎么也不会达到0.5。关于接种的整个过程都是在超净工作台上进行的，不知道出现这样的结果是什么问题。我已经作了很多次尝试，每次都是OD600达不到要求。

遇到这个问题，我真的很着急，因为等着克隆测序，所以想请大家帮忙指点迷津！感激不尽！！！
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努力，奋斗，拼搏。。。
1楼 2012-07-21 20:54:41
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chlorella409

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
从你的实验过程来看，你第一次的活化时间太长了，24小时有可能长出杂菌了，大肠杆菌培养时间一般是不超过16小时的。
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2楼2012-07-21 21:22:29
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含羞草liu

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by chlorella409 at 2012-07-21 21:22:29
从你的实验过程来看，你第一次的活化时间太长了，24小时有可能长出杂菌了，大肠杆菌培养时间一般是不超过16小时的。

有的，从16小时到24小时都试过的……
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努力，奋斗，拼搏。。。
3楼2012-07-21 22:40:10
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beautybanana

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
制作感受态细胞可以不用测OD值的，只要菌液比较浑浊就可以，即使不是十分浑浊，你多取些菌液离心增加菌的浓度仍然是可以的，这个很容易做的。一般用冷的CaCl法做感受态细胞是没有问题的，做好后分装到小管里，每管200uL左右用液氮立即冷冻，在放到-80℃冰箱保存即可。
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4楼2012-07-22 09:57:33
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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-07-24 13:36:46
"我用移液枪吸取菌液1ml放入100ml的液体LB培养基（250ml三角瓶装）", 250mL的瓶子最多装50mL就够了，多了通气不好菌就长不起来~~~你装了100mL，所以才长得特别慢~~
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5楼2012-07-22 15:56:55
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含羞草liu

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by liuyu_sdili at 2012-07-22 15:56:55
"我用移液枪吸取菌液1ml放入100ml的液体LB培养基（250ml三角瓶装）", 250mL的瓶子最多装50mL就够了，多了通气不好菌就长不起来~~~你装了100mL，所以才长得特别慢~~

补充一下，划线平板上的单菌落很多，没有全部移入液体培养基中，剩下的菌能保存下次使用吗？如果可以的话，怎么保存呢？是直接放在超净工作台中，还是放在4度冰箱？还有，配制好、灭过菌的固体或液体培养基没有使用完，也可以保存吗？4度冰箱保存行吗？
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努力，奋斗，拼搏。。。
6楼2012-07-22 17:52:41
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豆豆思密达

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以的，菌一般4度可以，培养基室温就行了。。。
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7楼2012-07-23 16:29:28
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liuyu_sdili

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 含羞草liu at 2012-07-22 17:52:41
补充一下，划线平板上的单菌落很多，没有全部移入液体培养基中，剩下的菌能保存下次使用吗？如果可以的话，怎么保存呢？是直接放在超净工作台中，还是放在4度冰箱？还有，配制好、灭过菌的固体或液体培养基没有使用 ...

最好还是现从冰箱冻存的甘油管中划线做感受态而不用4℃保存的，对于培养基，灭过菌没有打开的当然常温就可以，如果在超净台上打开的可以先室温放几天，没有长菌的也可以继续使用~~~
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8楼2012-07-23 17:58:51
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我可以猜测你的分光光度计坏了吗，我觉得有这个可能性，如果肉眼能看出来很浑浊，而分光光度计测不出来的话，就有这可能
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9楼2012-07-23 18:48:34
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nhtarnold

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我们做感受态都不用分光光度计，看着浑浊了离完心就会有很多，没必要非测OD600吧？
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10楼2012-07-24 10:09:56
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